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RNAs in der Pipeline

von Juliet Merz, Laborjournal 11/2019


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Lipid-Nanopartikel eignen sich zum Verpacken unterschiedlichster RNA-Moleküle. Illustr.: TRON Mainz

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(11.11.2019) Ob als Biomarker, Zielstruktur oder Therapeutika – nicht-codierende RNAs bergen großes Potenzial in der Diagnose oder Behandlung von Krankheiten. Denn die Nukleotide sind ein starkes zelluläres Kontrollmodul; das Verständnis rund um ihre Biologie steckt aber noch in den Kinderschuhen. So hat auch die weltweit erste nicht-codierende-RNA-Therapie ihren Entwicklern mächtig Kopfzerbrechen beschert.

Das Team rund um das Human Genome Project muss wohl ziemlich überrascht gewesen sein, als sich 2003 herausstellte, dass das Genom des Menschen nur zu etwa 1,5 Prozent aus Protein-codierenden Genen besteht. Und der Rest? Zumindest ein Großteil davon wird tatsächlich transkribiert und produziert ein breites Spektrum nicht-codierender RNAs, wie die beiden Forschungs-Konsortien Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) und Functional Annotation of the Mammalian Genome (FANTOM) herausfanden.

Diese scheinbar nutzlosen RNAs sind entgegen der damaligen Meinung alles andere als Genschrott: 2007 konnten australische Genomforscher um John Mattick von der University of Queensland in Brisbane zeigen, dass die relative Menge nicht-proteincodierender Sequenzen mit der Komplexität der Organismen stetig zunimmt (BioEssays 29: 288-99). Nicht-codierende RNAs scheinen also ganz im Gegenteil eine besonders wichtige Rolle in der Zelle einzunehmen.

Das erkennen Forscher und Ärzte immer mehr und wollen die RNA-Moleküle deshalb auch therapeutisch einsetzen. Doch das galt lange Zeit als hoffnungsloses Vorhaben, wie die beiden amerikanischen Chirurgen Bruce Sullenger und Smita Nair von der Duke University School of Medicine in einem Review-Artikel berichten (Science 352: 1417-20). Die relativ kurze Halbwertszeit in vivo sorge dafür, dass RNAs sich kaum als therapeutisches Werkzeug eigneten. Zwar konnte die immer besser werdende Stabilisierungs-Chemie die Skepsis schmälern, dennoch begegnen den Entwicklern von RNA-Therapien eine Reihe Stolpersteine. Aber dazu später mehr.

Doch was sind nicht-codierende RNAs überhaupt? Grob können nicht-codierende RNAs anhand ihrer Größe in zwei Kategorien unterteilt werden: kurze RNA-Stücke unter 200 Nukleotiden wie die small interfering (si)RNAs und microRNAs (miRNAs) sowie lange nicht-codierende (lnc)RNAs zwischen 200 und tausenden Nukleotiden. Eine ausführliche Beschreibung lesen Sie ab Seite 36.

In der Literatur tauchen miRNAs das erste Mal im Jahr 1993 auf. Zwei Labors hatten unabhängig voneinander im Fadenwurm Caenorhabditis elegans ein winziges RNA-Transkript (lin-4) entdeckt, welches das für die Wurmentwicklung wichtige Protein Lin-14 reguliert (Cell 75: 843-53 und 855-62).

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Heute sind nicht-codierende RNAs trotz der anfänglichen Skepsis Gegenstand zahlreicher Forschungsprojekte. Denn immer mehr wird klar: Die RNA-Moleküle können nicht nur Auslöser für zahlreiche Krankheiten sein, sondern diese auch positiv beeinflussen. Durch ihre Regulierung transkriptioneller und posttranskriptioneller Genexpression bilden sie ein mächtiges Kontrollmodul, das die Zellfunktion weitreichend beeinflusst. Dabei hemmen sie die Translation gezielter mRNAs nicht nur, sondern induzieren diese auch.

Eine einzige miRNA ist in der Lage, die Expression von über hundert mRNAs zu regulieren, während gleichzeitig jede mRNA von verschiedenen miRNAs beeinflusst werden kann – ein gefundenes Fressen für Off-Target-Effekte. lncRNAs hingegen können sich in unterschiedliche Sekundärstrukturen falten, um so mit DNA, RNA und Proteinen zu interagieren.

Welche physiologische und pathophysiologische Rolle nicht-codierende RNAs bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen spielen, untersucht Stefanie Dimmeler zusammen mit ihrem Team an der Goethe-Universität in Frankfurt am Main. Besonders im Fokus liegen miRNAs, lncRNAs sowie zirkuläre RNAs. Zirkuläre RNAs (circRNAs) sind eine weitere Klasse nicht-codierender RNAs, bei der lange nicht klar war, ob sie in Tieren überhaupt eine biologische Funktion erfüllen. 2013 brachte ein Berliner Forscherteam um Nikolaus Rajewsky vom Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Licht ins Dunkle: In einer Nature-Publikation konnte die Gruppe zeigen, dass circRNAs an miRNAs binden (495: 333-8). Sie regulieren quasi den Regulator. Dennoch: „Die Biologie und Prozessierung von circRNAs ist bislang noch schlecht verstanden“, klärt Dimmeler auf und ergänzt: „Es gibt bislang keine Beispiele, bei denen man mit Sicherheit sagen kann, dass circRNAs etwa bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen wichtig wären.“ Das müssten genetische Modelle erst noch beweisen. „Mit den lncRNAs und circRNAs befinden wir uns noch in der Grundlagenforschung“, kommentiert Dimmeler den aktuellen Stand und ergänzt: „Bei den miRNAs sind wir schon weiter.“

Gene stillgelegt

In der Klinik setzt man nicht-codierende RNAs ein, um mit ihnen therapeutisch relevante mRNAs durch posttranskriptionelles Gene Silencing zu inhibieren – auch RNA-Interferenz (RNAi) genannt. Die Möglichkeiten, dies zu tun, sind vielseitig. Als Hauptwerkzeuge dienen häufig entweder synthetisch hergestellte siRNAs, die den mRNA-zerschneidenden RISC-Komplex zur Ziel-mRNA führen, oder synthetische miRNAs, welche als Antisense-Stränge die Translation hemmen und ebenfalls zum Abbau der mRNA führen können.

Ein anderer Ansatzpunkt ist die Inhibierung pathogener nicht-codierender RNAs durch Sequenz-spezifische Antisense-Oligonukleotiden. Dimmeler gibt einen Einblick: 2009 konnte die Frankfurter Gruppe zeigen, dass die miRNA-92a in Mäusen das Wachstum neuer Blutgefäße (Angiogenese) kontrolliert (Science 324: 1710-3). Eine Überexpression der nicht-codierenden RNA in Endothelzellen führte in vitro und in vivo zu einer gehemmten Angiogenese. In verschiedenen Tiermodellen, darunter Maus und Schwein, konnten Dimmeler und ihr Team schließlich bestätigen, dass das zur miRNA-92a komplementäre Oligonukleotid anti-miR-92a (von Antisense-miRNA) sowohl die Heilung nach dem Herzinfarkt verbesserte, als auch die Durchblutung im Bein bei einer Ischämie-Erkrankung und die Wundheilung förderte.

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Illustr.: Juliet Merz

Nachdem die anschließenden toxikologischen Studien vielversprechend ausfielen, wurde das Projekt von dem amerikanischen Biotech-Konzern miRagen Therapeutics und dem französischen Pharmazieunternehmen Servier übernommen. Aktuell befindet sich der anti-miR-92a-Wirkstoff-Kandidat in zwei Phase-1-Studien mit insgesamt über 80 gesunden, freiwilligen Probanden. „Die eine Studie untersucht die Toxizität nach intravenöser Infusion [Anm. d. Red.: Studiennummer NCT03494712]. In der zweiten Studie werden den Probanden kleine Wunden zugefügt und beobachtet, wie schnell diese mit und ohne anti-miR-92a wieder heilen [Anm. d. Red.: NCT03603431].“ Die Auswertung sei in vollem Gange. „Wenn alles gut läuft, und so sieht es aktuell aus, möchten wir die Therapie in Patienten testen. Allerdings benötigen große klinische Studien viel Geld, was erst mal bereitgestellt werden müsste.“

Alternativ kann sich Dimmeler eine kleine klinische Studie vorstellen, in der etwa die Dosierung noch einmal überprüft werden könnte. „Entweder zielen wir dann auf eine Ischämie im Herz ab oder konzentrieren uns auf Wundheilung. Letzteres ist gerade bei Diabetes-Patienten kurz vor einer Operation sehr interessant und spannend, weil diese häufig an Wundheilungsstörungen leiden“, weiß Dimmeler. Doch bis anti-miR-92a als Therapie Patienten zur Verfügung steht, kann es noch ein bisschen dauern. Laut der Frankfurter Biologin mindestens noch fünf Jahre.

Neben anti-miR-92a haben es auch noch andere Antisense-Oligonukleotide zur Blockierung pathogener miRNAs in klinische Studien geschafft. Anti-miR-21 beispielsweise ist ein potenzieller Wirkstoff gegen das Alport-Syndrom, einer genetisch bedingten Nierenerkrankung. Entwickelt von den beiden amerikanischen Unternehmen Regulus Therapeutics und Genzyme (Sanofi) befindet sich anti-miR-21 derzeit in der klinischen Phase 2.

Ein anderes Beispiel ist anti-miR-155. Das Oligonukleotid hat ebenfalls die klinische Phase 2 erreicht und soll beim kutanen T-Zell-Lymphom (CTCL) das Tumorwachstum bremsen. Wie anti-miR-92a steht auch anti-miR-155 unter der Obhut von miRagen Therapeutics.

Dennoch ist die Entwicklung der miRNA-Therapien knifflig, wie Dimmeler weiß: „Die Schwierigkeit der miRNAs ist, dass ihre normale, spezifische Funktion in der Zelle sehr kompliziert ist. Dazu kommt, dass sie nicht die gleiche Funktion in Zelle A und Zelle B haben. Der Nachteil der miRNAs ist also, dass sie viele Targets anspielen – was allerdings auch ein Vorteil sein kann. Denn man kann meiner Meinung nach chronische Erkrankungen nur durch Netzwerk-Beeinflussung beheben. Es ist meist nämlich nicht nur ein Weg, der falsch läuft.“

Falsche Hoffnung

Ein weiteres potenzielles Anwendungsgebiet nicht-codierender RNAs in der Klinik ist ihr Einsatz als diagnostische Biomarker.

Anfang dieses Jahres hatte ein Brustkrebs-Screening des Universitätsklinikums Heidelberg und dessen ausgegründetes Unternehmen HeiScreen für mächtig Aufsehen gesorgt. Ein Bluttest zur Brustkrebs-Früherkennung, bei dem unter anderem miRNAs gemessen werden, sei „ein Meilenstein in der Brustkrebsdiagnostik“, hieß es in der mittlerweile zurückgezogenen Pressemitteilung (LJ berichtete: „Schnellstart für Krebstest“ vom 21.03.19). Die PR-Abteilung ruderte schließlich kräftig zurück und entschuldigte sich, denn: Der Test ist nicht sensitiver als die Mammographie, und mit 30 Prozent unterliegt die Falsch-Alarm-Rate des Brustkrebs-Tests sogar der Mammographie (5 bis 10 Prozent).

Die Zeit der nicht-codierenden RNAs als Biomarker scheint noch nicht gekommen. Zumindest für Herz-Kreislauf-Erkrankungen zieht Dimmeler eine Bilanz: „Als Biomarker für Herzinfarkt sind miRNAs aktuell lediglich genauso aussagekräftig, wie bereits etablierte Methoden.“ Dennoch seien besonders miRNAs als Biomarker gut geeignet. Weniger erfolgversprechend seien hingegen lncRNAs. „Die Menge, die man im Blut findet, ist sehr gering“, spricht die Frankfurter Biologin einen Minuspunkt der RNA-Moleküle an. „Wir bekommen in unseren Studien zumindest keine guten, verlässlichen Daten hin.“

Sven Diederichs vom Universitätsklinikum Freiburg und dem Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) in Heidelberg untersucht die lncRNAs im Zusammenhang mit Lungenkrebs und Metastasierung. Er kennt eine Ausnahme bei lncRNAs, die zuhauf im Blut vorkommt: MALAT1.

Die lncRNA hatte Diederichs während seiner Doktorarbeit 2003 entdeckt und gezeigt, dass sie als Marker für metastasierenden Lungenkrebs gilt. „Je mehr MALAT1 die Tumorzellen bilden, desto wahrscheinlicher ist es, dass Metastasen auftreten und die Krankheit sehr ungünstig verläuft“, erklärt der Biochemiker und geht dann auf die Rolle von MALAT1 als möglichen diagnostischen Biomarker ein: „MALAT1 finden Sie in sehr vielen unterschiedlichen Geweben, das dazugehörige Gen liegt in sehr hoher Kopienzahl in der Zelle vor, es scheint relativ stabil zu sein und kommt sogar im Blutplasma vor, was für viele andere lncRNAs nicht notwendigerweise gilt.“ Und dennoch: MALAT1 ist kein guter Kandidat für einen diagnostischen Biomarker. „Die Tatsache, dass das Molekül in vielen Organen vorkommt, macht es zu einem wenig spezifischen Marker“, meint Diederichs und erklärt weiter: „Einerseits könnte im Körper ein metastasierender Tumor eine größere Menge MALAT1 ins Blut abgeben, andererseits könnte ein erhöhter Wert aber auch auf anderem Wege passiert sein. Etwa, weil in einem benachbarten Gewebe Zellen durch eine Verletzung zerstört wurden und so viele der lncRNAs ins Blutplasma gelangen konnten.“

Deshalb hat Diederichs für MALAT1 ein anderes Ziel vor Augen. In einer 2013 erschienenen Studie konnte Diederichs’ Team zusammen mit dem amerikanischen Pharmaunternehmen Ionis Pharmaceuticals (damals Isis Pharmaceuticals) mithilfe eines Antisense-Oligonukleotids MALAT1 blockieren, was die Metastasierung von in Mäusen implantierten Tumoren verhinderte (Cancer Res. 73: 1180-9). Auf Nachfrage teilte Ionis mit, weiter an der Entwicklung zu arbeiten.

Neben den Antisense-Oligonukleotiden hatte es 2013 erstmals eine miRNA in die klinische Phase 1 geschafft, ihr Name: MRX34. Das synthetische miRNA-Imitat sollte in Leber-Tumorzellen die verloren gegangene Suppressorfunktion von endogener miRNA-34 wiederherstellen. Das therapeutische MRX34 reguliert direkt mindestens 24 Onkogene, die am Zellzyklus, der Zellproliferation, der Anti-Apoptose, Metastasierung, Chemoresistenz, Selbsterneuerung von Krebszellen und der onkogenen Transkription beteiligt sind. Auftraggeber der Studie war das texanische Unternehmen Mirna Therapeutics. „But others in the field have raised concerns about Mirna’s ‚replacement‘ strategy“, berichtete der Journalist Aaron Bouchie in den Nature-Biotechnology-News (13: 577).

Studie gestoppt

Drei Jahre später sollten sich die Zweifel bestätigen. Im September 2016 stoppte das Unternehmen freiwillig die laufenden Phase-1-Studien mit MRX34. Der Grund: Nachdem Patienten der Produktkandidat verabreicht wurde, waren mehrere immunbedingte schwerwiegende unerwünschte Ereignisse (SAEs von Serious Adverse Events) aufgetreten. Drei Personen starben.

Laut Christoph Roderburg und Kollegen vom Universitätsklinikum der Rheinisch-Westfälischen Hochschule Aachen schränken gerade Off-Target-Effekte die therapeutische Anwendbarkeit der nicht-codierenden RNAs ein, wie sie in einem Übersichtsartikel in Bezug auf Lebererkrankungen schreiben (Front. Pharmacol. 9: 805). „Therapeutisch verabreichte miRNA-Mimetika werden von Toll-like-Rezeptoren des angeborenen Immunsystems detektiert, was zur Sekretion von Interleukin-6 und Tumornekrosefaktoren führt.“ Darüber hinaus könnten verschiedene miRNA-Formulierungen durch Makrophagen und Monozyten beeinflusst werden, zitieren die Autoren eine Studie des Schweizer Krebsforschers Mario Leonardo Squadrito et al. (Trends Immunol., doi: 10.1016/j.it.2013.02.003). Ein weiterer beobachteter Nebeneffekt ist die Hemmung der Gerinnung, Lebertoxizität und Aktivierung der Komplementkaskade, einer Form der Immunantwort.

„Auch bei Protein-Therapien können Effekte auftreten, die in einer Behandlung nicht erwünscht wären“, ordnet Dimmeler ein. „Allerdings haben wir die Biologie der nicht-codierenden RNAs und daher auch ihre unterschiedlichen Targets eben noch nicht so gut verstanden.“

Die bislang größte Hürde, mit der RNA-Therapeutika-Entwickler zu kämpfen haben, besteht im Delivery der Wirkstoffe. Roderburg et al. erklären, dass etwa synthetische, nicht modifizierte, „nackte“ Oligonukleotide von Serum- und Zellnukleasen abgebaut oder durch ihre Größe und negative Ladung schlecht aufgenommen würden, was ihre Beförderung zum Ziel erschwere. Als Lösung schlagen die Autoren chemische Modifikationen mit einer geeigneten Sequenz und eine optimale Oligonukleotid-Konzentration vor.

Als besonders heikel gilt auch, die RNA-Therapeutika zuerst in das richtige Organ zu verfrachten. „Wenn ich eine Substanz in den Blutkreislauf gebe, gelangt sie natürlich auch in die Leber und bleibt dort gegebenenfalls hängen“, kommentiert Diederichs. „Als Ziel­organ ist die Leber deshalb sehr attraktiv.“ Roderburg und Co. nennen in diesem Zusammenhang auch die Niere und Milz.

Als alternative Transportmethode schlägt Diederichs etwa das Koppeln von siRNAs an Antikörper vor. Roderburg et al. fassen schließlich in ihrem Übersichtsartikel zusammen, dass neben chemischer Modifikation der nicht-codierenden RNAs auch ihre Verpackung in Liposomen, der Transport durch Viren und ihre Beladung auf Nanopartikel das Delivery zum Zielort verbessern könne.

Auch die in Cambridge (USA) sitzende Firma Alnylam Pharmaceuticals kämpft mit dem Transport der RNA-Wirkstoffe. Ihre Aufgabe: eine siRNA zur Behandlung von vererbbarer Transthyretin-Amyloidose (einer rheumatischen Erkrankung) unbeschädigt durch den Blutkreislauf in die menschliche Leber zu bugsieren. Vor einigen Jahren versuchten Alnylam-Forscher schließlich die siRNA mit N-­Acetylgalactosamin (GalNAc) zu koppeln, einem Zucker, der von einem in der Leber reichlich exprimierten Rezeptor gebunden wird. Das Vorhaben gelang, doch die anschließenden Experimente mit dem Wirkstoff namens Revusiran endeten 2016 abrupt, als in einer Phase-3-Studie im Menschen mit Amyloidose-assoziierter Herzkrankeit bei behandelten Probanden mehr Todesfälle auftraten als in der Placebo-Gruppe. Die Todesursache ist weiterhin unklar, die Formulierung von ­Revusiran scheine dazu beigetragen zu haben, wie Alnylam-Geschäftsführer John Maraganore im Interview äußert: „The data seem to suggest that metabolites of that drug given at those doses might have been poorly tolerated in that very frail population” (Nature 574: S4-6).

Riskante RNA-Therapie

Schließlich setzte das Unternehmen auf einen anderen Lösungsvorschlag – mit Erfolg. Forscher um den französischen Neuropathologen David Adams vom Centre Hospitalier Universitaire (CHU) Bicêtre in Paris modifizierten in Zusammenarbeit mit Alnylam-Kollegen die siRNA leicht und packten sie in ein Lipid-Nanopartikel (N. Engl. J. Med. 379(1): 11-21). Das Resultat: Nach 20 Jahren Forschung brachte Alnylam 2018 die erste siRNA-Therapie auf den Markt mit dem Namen Parisiran, vermarktet unter dem Namen Onpattro.

Trotz der anfänglichen Schwierigkeiten arbeitet das amerikanische Unternehmen bereits an einer neuen Therapie-Version, die wieder einmal auf GalNAc-Kopplung setzt. Warum geht das Unternehmen dieses Risiko nach dem massiven Fehlschlag 2016 ein? Die Gründe dafür nennt Douglas Fambrough, Geschäftsführer eines weiteren auf RNAi-setzenden Unternehmens namens Dicerna Pharmaceuticals, im Nature-Outlook-Artikel: „[Bei GalNAc-Kopplung gibt es] weniger toxikologische Belastung, es ist einfacher herzustellen, es hält länger und es ist einfacher zu verabreichen.“ Sprich: GalNAc ermöglicht die subkutane Injektion von RNAi-Therapien, anstatt der intravenösen Verabreichung wie es bei Parisiran der Fall ist. Außerdem muss bei Parisiran alle drei Wochen injiziert werden, bei einer subkutanen Verabreichung dank der Stabilisierungschemie der RNA reichen drei Monate. Alnylam ist das Risiko bereits eingegangen, und hat die RNAi-Therapie auf Basis einer GalNAc-Kopplung unter dem Namen Vutrisiran in eine Phase-3-Studie geschickt.

Das Potenzial nicht-codierender RNAs als Tools oder Targets in der Klinik ist groß, obgleich die noch verschleierte Biologie der RNA-Moleküle und ihr kniffliger gezielter Transport große Hürden darstellen. Dennoch ist sich Diederichs sicher: „Einzelne nicht-codierende RNAs können in Zukunft den gleichen klinischen Erfolg haben wie Proteine – sowohl als Biomarker, als Therapeutika wie auch als Zielstrukturen.“

Last Changed: 10.11.2019

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