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Tipp 180: Chromosomen-Sieb

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Trick 180

Die mit der Filter-Methode gereinigten Chromosomen sind für verschiedene nachfolgende Techniken geeignet, etwa für das hier zu sehende Chromosomen-Painting.

Bei der Reinigung von Chromosomen mit herkömmlichen Methoden bleibt ein großer Teil auf der Strecke. Wesentlich höhere Ausbeuten verspricht ein neues Filtrationsverfahren.

Humane Chromosomen werden meist mit der Polyamin-Methode isoliert. Bei dieser inkubiert man die Zellen zunächst mit ­Colcemid, um sie in der Metaphase zu arretieren. Anschließend pumpt man die Zellen mit einer hypotonen Kaliumchlorid-Lösung auf und suspendiert sie nach dem Abzentrifugieren in eiskaltem Polyamin-Puffer. Mit ein paar Runden auf dem Vortexer oder der Passage durch eine Spritzenkanüle bewegt man die Zellkerne schließlich dazu, die Chromosomen in den Polyamin-Puffer zu entlassen.

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Viel Aufwand, wenig Ausbeute

Da die hieraus resultierende Suspension neben den Chromosomen auch nicht geplatzte, intakte Kerne und allerlei Zellschrott enthält, muss man die isolierten Chromosomen weiter putzen. Dies geschieht meist durch Zentrifugation (mit oder ohne Sucrose beziehungsweise Percoll-Gradienten) oder in speziellen Trennkammern, die einem Gravitationsfeld ausgesetzt werden. Mit diesen Methoden erhält man zwar durchaus brauchbare Chromosomen. Oft lässt aber die Ausbeute zu wünschen übrig und auch der Zeit- und Materialaufwand ist hoch.

Einfach und schnell

Es geht aber auch viel einfacher. Einige wenige Filtrationsschritte, die nicht mehr als 20 Minuten Zeit beanspruchen, reichen für die Reinigung aus. Wie diese funktionieren, beschreibt Ian Robinson‘s Gruppe vom Londoner University College in der Maiausgabe der Zeitschrift Biotechniques, (Yusuf et al., 56:257-61).

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Für die Filtration der Chromosomen benötigt man vier Rundfilter mit den Porengrößen 41µm, 10 µm, 5 µm und 3 µm. Im ersten Schritt des Protokolls legt man diese in die passenden, mit Anschlüssen für Plastikspritzen versehenen Filter-Halterungen ein. Wichtig ist, die Filter nicht zu überladen. Man sollte deshalb zunächst die Konzentration der Chromosomen analysieren. Hierzu platziert man einen Tropfen der Suspension auf einen Glasträger und versetzt ihn mit 150 µm SYBR Gold. Auf den Tropfen kommt ein Deckgläschen, dessen Ränder man mit Nagellack versiegelt. Anschließend bestimmt man die Dichte der Chromosomen mit dem ­Fluoreszenz-Mikroskop. Sie sollte bei etwa 12.000 Chromosomen pro Mikroliter liegen.

Mit einer Plastikspritze drückt man etwa einen Milliliter der Chromosomen-Suspension durch den 41 µm-Filter und fängt den Durchfluss in einem sauberen Reaktionsgefäß auf. Diese Prozedur wiederholt man mit den 10 µm- und 5 µm-Filtern, die alle Zellbruchstücke aussieben, die größer als der jeweilige Porendurchmesser sind.

Anschließend ist der 3 µm-Filter an der Reihe. Da Chromosomen größer als 3 µm sind, passen sie nicht durch dessen feine Poren und werden zurückgehalten. Den Filter mit den anhaftenden Chromosomen nimmt man mit einer Pinzette vorsichtig aus der Halterung und setzt ihn mit der Filterseite nach unten in eine neue ein. Das ist der eigentliche Trick bei dieser Methode. Die Chromosomen spült man schließlich mit 1 ml Polyamin-Puffer vom Filter und fängt sie in einem sauberen Gefäß auf.

Weniger Verluste

Die Ausbeuten bei den einzelnen Filterschritten sollte man wie oben beschrieben mit dem Fluoreszenz-Mikroskop überprüfen. Sie sind in der Regel erstaunlich gut. Von den ursprünglich eingesetzten Chromosomen fanden Yusuf et al. etwa ein Drittel wieder. Bei der Zentrifugations-Methode erzielte die Gruppe lediglich Ausbeuten von knapp 9 %, beim Sucrosegradienten-Verfahren landeten fast alle Chromosomen (99,5 %) im Ausguss.

Harald Zähringer



Letzte Änderungen: 10.06.2014


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