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Nicht-ribosomale Peptidsynthetase

von Juliet Merz (Laborjournal-Ausgabe 1-2, 2020)


(09.02.2020) Sie sind wahre Riesen unter den Enzymen und gehören gleichzeitig zu den wichtigsten mikrobiellen Proteinen: die nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen (NRPSs). Als Ribosomen-Alternative produzieren NRPSs im Akkord die unterschiedlichsten Peptide und kleine Moleküle, die nicht nur für den Organismus selbst eine große Rolle spielen, sondern auch für uns Menschen als Therapeutika in Frage kommen.

Die bislang größte bakterielle NRPS heißt Kolossin-Synthetase und stammt aus dem Gammaproteobakterium Photorhabdus luminescens. Die Sequenz des 1,8 Megadalton großen Kolosses – das ist größer als die große Untereinheit der bakteriellen Ribosomen – besetzt circa ein Prozent des gesamten Erbguts. Andere Bakterien setzen da noch einen drauf und schleppen bis zu 15 unterschiedliche NRPSs mit sich rum.

Kein Wunder, denn von NRPSs produzierte nicht-ribosomale Peptide sind für Bakterien und Pilze äußerst wichtig. Sie übernehmen Funktionen im Zellmetabolismus oder sorgen als Abwehrstoffe für evolutionäre Vorteile.

Nicht-ribosomale Peptide sind extrem vielseitig. Im Gegensatz zu Ribosomen können NRPSs neben den proteinogenen Aminosäuren auch die unterschiedlichsten Moleküle in das neue nicht-ribosomale Peptid einbauen. Das Montageprinzip ist derweil bei allen NRPSs gleich: Eine NRPS verfügt über mehrere Module, die wiederum in mindestens drei Domänen unterteilt sind – die Adenylierungs (A)-Domäne, die 4’-phosphopantetheinylierte Thiolierungs (T)-Domäne und die Kondensations (C)-Domäne. Während die A-Domäne die Auswahl und Aktivierung der Aminosäuren übernimmt, trägt die T-Domäne die Aminosäuren und die C-Domäne verknüpft die Aminosäuren der jeweiligen Module, sodass die Peptidkette wächst. Die Domänen-Reihenfolge in einem Modul lautet C-A-T, wobei noch zusätzliche Domänen hinzukommen können. Dazu zählen Domänen mit Oxidase-, Reduktase-, Epimerisierungs-, Ketoreduktase-, Aminotransferase- und Methyltransferase-Funktion. Die maßgeschneiderten Domänen können unzählige Substrate einbauen: Etwa die nicht-proteinogenen D-Aminosäuren, Arylsäuren, Hydroxysäuren sowie Fettsäuren, aber auch Ringstrukturen wie Thiazole oder Oxazole.

Eines der bekanntesten nicht-ribosomalen Peptide ist das elf Aminosäuren große Ciclosporin (früher Cyclosporin A), das 1971 Forscher des Novartis-Tochterkonzerns Sandoz im Bodenpilz Tolypocladium inflatum entdeckt hatten. Als Immunsuppressivum kommt Ciclosporin insbesondere bei chronischen Erkrankungen des Darms, der Haut, aber auch des Auges und der Mundschleimhaut zum Einsatz.

Zu den nicht-ribosomalen Peptiden gehören aber auch Antibiotika, antitumorale sowie antivirale Stoffe, Emulgatoren oder Siderophore – um nur ein paar zu nennen.

2008 eröffneten französische Informatiker eine Datenbank mit dem Namen Norine zur Erfassung nicht-ribosomaler Peptide (https://bioinfo.lifl.fr/norine/). Seitdem haben Forscher weltweit 1.730 Peptide in die Datenbank eingetragen.

Heiß begehrt

Nicht-ribosomale Peptide sind aufgrund ihrer zahlreichen Funktionen äußerst begehrt. Biotechnologen versuchen die NRPSs als Werkzeuge zur Synthese neuer nicht-ribosomaler Peptide zu nutzen. Helge Bode von der Goethe-Universität in Frankfurt am Main hatte vergangenes Jahr im Laborjournal berichtet, wie er die NRPSs selbst designen möchte (Link LJ 5/19).

Mit Kollegen hatte er die sogenannte Exchange-Unit-Methode entwickelt. Dabei entwerfen die Forscher beliebige Peptide und die Gensequenz der dazu passenden NRPS. Den Zusammenbau der Gensequenz übernehmen Hefezellen, um die anschließende Assemblierung des Enzyms kümmert sich E. coli. Leider glückte der Zusammenbau in den Bakterien nicht immer. Die Lösung entdeckte der promovierende Bioinformatiker Kenan Bozhüyük: Eine konservierte Stelle in der C-Domäne entpuppte sich als ideale Schnittstelle, um daran beliebig Module anzuknüpfen und erfolgreich NRPSs zu synthetisieren. Bode kommentierte damals, die C-Domäne sei weiterhin ein Rätsel, wie sie genau funktioniert, wisse niemand so genau.

Strukturbiologen und Biochemiker der McGill University in Montréal, Kanada, der Sorbonne Université sowie dem Centre National de la Recherche Scientifique in Paris konnten kürzlich den Montageprozess der NRPS weiter entschlüsseln (Science 366: 706). Dazu pickte sich das Forscherteam um Martin Schmeing eine Untereinheit der insgesamt 16 Modul großen linearen Gramicidin-Synthetase heraus, einer NRPS, die das gleichnamige Antibiotikum synthetisiert. Die untersuchte Untereinheit bestand aus zwei Modulen, einem zur Initiation und einem zur Elongation der entstehenden Peptidkette. Für Schmeing und Co. war besonders interessant, wie sich die Module während des Montageprozesses gegeneinander verhalten. Gepaart mit NRPS-Substraten, -Substratanaloga und Dead-End-Inhibitoren durchlief die Untereinheit mehr als 100.000 Kristallographie-Screenings. Schließlich erzeugte das Team fünf aussagekräftige Kristallstrukturen, welche das Enzym in unterschiedlichen Aktivitätszuständen zeigten.

Die Strukturen offenbarten zuvor unbeobachtete Zustände, etwa eine vollständige Kondensationskonformation, bei der die T-Domäne sowohl aus dem Initiations- als auch aus dem Elongationsmodul gleichzeitig an die C-Domäne gebunden war. Besonders interessant: Während der Konformationsänderungen scheinen die Module große Bewegungen auszuführen. Und die Forscher machten noch eine spannende Beobachtung: Die Wechselwirkung der T- und C-Domäne im Zuge der Kondensation scheint der einzige Punkt zu sein, an dem sich die benachbarten Module koordinieren müssen. An anderen Stellen im Montageprozess ist die Konformation des Enzyms laut Kristallstrukturanalysen variabel und damit unerheblich. Diese beiden Punkte konnten die Forscher auch durch Röntgenkleinwinkelstreuung bestätigen.

Schließlich tauchten die Forscher noch ins Bioengineering ein und führten anhand ihrer Ergebnisse zwei Punktmutationen an der Schnittstelle der T- und C-Domänen ein – was die Aktivität des Enzyms verdoppelte.



Letzte Änderungen: 09.02.2020

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