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Produktübersicht: Fluoreszenzfarbstoffe

Fluoreszenzfarbstoffe im Überblickpdficon

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(11.11.2020) Fluoreszenzfarbstoffe sind die heimlichen Stars in biowissenschaftlichen Laboren. In unzähligen Assays und Labortechniken sorgen sie dafür, dass den Experimentatoren im wahrsten Sinne des Wortes ein Licht aufgeht.

Ohne Fluoreszenzfarbstoffe gäbe es weder Fluoreszenz-Mikroskopie sowie Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrie (FACS)noch höchstauflösende Mikroskopie wie STED oder dSTORM – auch bei den meisten Zellassays und Detektions-Verfahren bliebe es ohne sie zappenduster. Kurzum, ohne Fluoreszenzfarbstoffe wäre die moderne biomedizinische Forschung ziemlich aufgeschmissen und schlicht nicht vorstellbar.

Ihren ersten Auftritt in den Laboren hatten fluoreszierende Farbstoffe in den Siebzigerjahren als sie insbesondere den damals neuentwickelten FACS-Geräten zum Durchbruch verhalfen. Die Auswahl war aber noch recht bescheiden: Sie bestand im Wesentlichen aus dem grün fluoreszierenden Fluorescein und dem rot fluoreszierenden Rhodamin. Die molekularen Strukturen dieser beiden Farbstoffe sind sehr ähnlich und erfüllen einige wichtige Grundprinzipien, die für sämtliche klassische Fluoreszenzfarbstoffe gelten: Die Basisstruktur ist ein ebenes durchkonjugiertes Doppelbindungs-System (delokalisiertes Pi-Elektronen-System) ohne funktionelle Gruppen, die strahlungslose Übergänge zwischen angeregtem und Grundzustand begünstigen würden. Stattdessen ergänzt man die Grundstruktur mit Substituenten, die anregbare, nichtbindende Elektronen enthalten, um die Fluoreszenzeigenschaften zu modifizieren.

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Ebenes Grundgerüst

So besteht zum Beispiel Rhodamin aus einem planaren Xanthen-Grundgerüst, das aus drei nebeneinanderliegenden Benzolringen aufgebaut ist, wobei im mittleren Ring ein Kohlenstoffatom durch ein Sauerstoffatom ersetzt ist. Als zusätzliche Substituenten sitzen am linken und rechten Ring je eine Aminogruppe und zusätzlich am mittleren Ring ein Benzoesäurerest.

Diese relativ einfache Grundstruktur, die der Chemiker Maurice Ceresole von BASF in Ludwigshafen bereits 1887 herstellte, genügte den Ansprüchen der Biowissenschaftler aber bald nicht mehr. Sie wollten Rhodamin-Farbstoffe, die eine größere Bandbreite bei den Absorptions- und Emissionsmaxima abdeckten als zum Beispiel das gängige Tetramethylrhodamin (TMR). Um die Banden zu verschieben, modifizierten Farbstoff-Chemiker die Substituenten und schufen hierdurch eine Vielzahl von Rhodamin-Varianten, die vom gängigen Texas-Red für das Labeling von Proteinen oder Antikörpern bis zu den aktuellen Janelia-Fluor(JF)-Farbstoffen reichen, die für Zell-Imaging und Nanoskopie geeignet sind.

Hinter den Janelia-Farbstoffen steckt mit Luke Lavis vom Janelia Research Campus in Ashburn, USA, einer der kreativsten Farbstoff-Chemiker der Szene, der insbesondere Farbstoffe für die höchstauflösende Mikroskopie optimiert.

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Etwa 30 fluoreszierende Moleküle bilden die Basis für unzählige Fluoreszenzfarbstoffe, die für das Imaging von Zellen eingesetzt werden.
Große Darstellung. Illustration: Luke Lavis

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Strahlend hell durch Vierring

Seine jüngste Schöpfung sind Rhodamin-Derivate, bei denen sein Team die Aminogruppen durch einen Vierring mit einem Stickstoffatom (Azetidin) ersetzte (Nat. Methods 14: 987-94). Mit zusätzlichen Resten an den beiden Azetidin-Ringen, die Elektronen unterschiedlich stark anziehen, etwa elektronegative Fluor-Atome im Gegensatz zu elektropositiven Methyl-Gruppen, fein-tunte Lavis Gruppe die Anregungsmaxima der synthetisierten Janelia-Farbstoffe. Zu guter Letzt versah sie Lavis Mannschaft mit einem Halo- oder SNAP-Tag, mit denen sie sehr einfach als Fluoreszenz-Label an ausgesuchte Zielproteine angeheftet werden können.

Um Abnehmer für seine Farbstoffe muss sich Lavis keine Sorgen machen. Auf dem Janelia Research Campus werkelt unter anderem Nobelpreisträger Eric Betzig an ausgefeilten Nanoskopie-Techniken und nutzt dazu die Janelia-Palette. Auch andere internationale Imaging-Gruppen, etwa die von Markus Sauer an der Universität Würzburg, arbeiten mit Lavis zusammen und experimentieren mit seinen Farbstoff-Kreationen.

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Der Nachbargruppen-Effekt sorgt bei 4'-Carboxyamid-Rhodamin dafür, dass der modifizierte Farbstoff die Zellmembran viel leichter passieren kann als das ursprüngliche Rhodamin. Illustration: Gražvydas Lukinavičius/Hartmut Sebesse

Was man aus dem bald 150 Jahre alten Rhodamin immer noch herauskitzeln kann, zeigt auch Gražvydas Lukinavičius Gruppe am Max Planck-Institut für biophysikalische Chemie in Göttingen. Mit einigen Tricks synthetisierte sie ein 4'-Carboxyamid-Rhodamin, das direkt neben der Carboxyl-Gruppe der Benzoesäure einen zusätzlichen Amid-Rest beherbergt, der Erstaunliches bewirkt: Er erhöht die Zellpermeabilität um ein Vielfaches gegenüber klassischen Rhodamin-Derivaten und stabilisiert die fluoreszierende Form des Farbstoff-Moleküls, wodurch sich dessen Fluoreszenz verstärkt (Chem. Sci. 11: 7313).

Die Göttinger verknüpften den neukreierten Farbstoff mit Liganden, die an Tubulin, Actin oder DNA binden, und nutzten diese Proben unter anderem für das Lebendzell-Imaging mithilfe der STED-Mikroskopie.

Immer wieder Rhodamin

Seit einigen Jahren macht der Farbstoff SiR-Hoechst (SiR-DNA) Furore, mit dem man zum Beispiel den Zellkern für Imaging-Experimente mit fernem Rotlicht anfärben kann. Auch SiR-Hoechst ist ein Rhodamin-Farbstoff. Allerdings wurde das Sauerstoff-Atom im Xanthen-Gerüst durch ein Silicium-Atom (Si) ersetzt und gleichzeitig der DNA-bindende Farbstoff Hoechst über eine Carboxyl-Gruppe an Position 6 des Benzolrings angehängt.

SiR-Hoechst ist aber nicht besonders hell und wird durch Zellpumpen der Multidrug-Resistenz schnell aus der Zelle herausgeschleust. Lukinavičius Gruppe fand jedoch einen Trick, mit dem man diese Schwachpunkte beseitigen kann: Sie knüpfte den Hoechst-Farbstoff an eine 5'-Carboxyl-Gruppe statt an eine 6'-Carboxyl-Gruppe von Rhodamin. Bei STED-Experimenten, die Lukinavičius Mitarbeiter zusammen mit Stefan Hell durchführten, leuchteten die mit 5'-Carboxy-Rhodamin gefärbten Zellkerne wesentlich heller als mit den üblichen 6'-Carboxy-Rhodamin-Hoechst-Farbstoffen (Chem. Sci. 10: 1962).

Viele der populären Alexa-Farbstoffe basieren ebenfalls auf Rhodamin-Derivaten. Sie enthalten jedoch zusätzliche Sulfonsäure-Reste, wodurch sie eine negative Ladung annehmen und sich besser in Wasser lösen. Alexa-Farbstoffe bilden hierdurch seltener Aggregate und sind photostabiler als die Ausgangsmoleküle. Die Stabilisierung durch die Sulfonyl-Gruppe funktioniert aber nicht nur mit Rhodaminen, sondern auch mit anderen gängigen Fluoreszenzfarbstoffen, etwa Coumarinen oder Cyaninen.

Noch ziemlich neu auf der Farbstoffpalette sind BODIPY-Fluorophore. Der etwas merkwürdige Name geht auf ihre Grundstruktur aus zwei Pyrrol-Ringen zurück, die über eine Methin-Brücke miteinander verknüpft sind – ganz ähnlich wie die Pyrrole im Porphyrin-Ring von Häm. Im Unterschied zu Häm fehlen aber die zwei weiteren Pyrrole, um den Ring zu schließen. Zudem sind die beiden Pyrrol-Stickstoffatome nicht mit einem Eisen-Atom koordiniert, sondern einem difluorierten Bor. Das Molekülgerüst wird deshalb als Bordipyrrol bezeichnet oder kurz BODIPY. Wie bei anderen Farbstoffen lassen sich wichtige Eigenschaften wie Löslichkeit oder Anregungswellenlänge mit zusätzlichen Substituenten an den Pyrrol-Ringen gezielt steuern. Wählt man diese geschickt aus, erhält man BODIPY-Derivate, die fast alles haben, was sich Biowissenschaftler von Fluoreszenzfarbstoffen wünschen: hohe Quantenausbeuten und Extinktionskoeffizienten, scharfe Emissionsbanden, eine ausreichende Photostabilität, fast kein Auslöschen (Quenchen) durch Luftsauerstoff sowie eine vom pH-Wert unabhängige Intensität der Fluoreszenz.

BODIPYs decken zusammen mit den anderen gängigen Fluoreszenzfarbstoffen das sichtbare Spektrum des Lichts sowie die angrenzenden ultravioletten und nah-infaroten Wellenlängen ab. Sie sind deshalb für das Fluoreszenz-Imaging in Zellen oder sehr kleinen Modellorganismen wie Zebrafischen geeignet. In größeren Organismen, etwa Mäusen, dringt sichtbares Licht aber nicht mehr tief genug in das Gewebe ein. Zudem nimmt die Autofluoreszenz im Inneren der Organismen sehr stark zu und verhindert eine scharfe Auflösung der Bilder. In größeren Modellorganismen oder Organen arbeiten Forscher deshalb meist mit kurzwelligem Infrarotlicht (SWIR), dessen Wellenlänge von 1.000 bis 2.000 Nanometern weit jenseits der Anregungsmaxima üblicher Fluoreszenzfarbstoffe liegt. Der Biochemiker Oliver Bruns vom Helmholtz Zentrum München entwickelte deshalb zusammen mit Kollegen von der University of California, Los Angeles, eine Serie sogenannter Flavyliumheptamethin-Farbstoffe für das SWIR-Imaging (Nat. Chem., doi:10.1038/s41557-020-00554-5).

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Oliver Bruns Team vom Helmholtz-Zentrum München synthetisierte Flavyliumheptamethin-Farbstoffe für bildgebende Verfahren mit kurzwelligem Infrarotlicht. Bei der abgebildeten Maus sind die Organe mit verschiedenen Flavylium-Farbstoffen gefärbt: Gefäße rot, Bauchraum blau, Leber und Darm grün. Foto: Helmholtz-Zentrum München
Rotverschiebung durch lange Kette

Bruns Gruppe nutzte für diese das Grundgerüst der in den Biowissenschaften sehr häufig eingesetzten Cyanin(Cy)-Farbstoffe. Dieses besteht aus zwei (quartären) aromatischen Heterozyklen, zum Beispiel Pyridinen, die über eine Polymethin-Kette verbunden sind. Je länger die Kette ist, desto stärker ist die Rotverschiebung des Absorptionsmaximums. So absorbieren typische Cyanin-Farbstoffe mit 1 bis 5 Methin-Einheiten im sichtbaren Lichtspektrum, solche mit 7 dagegen bereits im nahen Infrarot. Bruns Team synthetisierte in einer früheren Arbeit den bei 1.027 Nanometern absorbierenden Flavyliumheptamethin-Farbstoff Flav7, bei dem die zwei Heterozyklen (Flavylium) durch sieben Methin-Einheiten verknüpft sind (Angew. Chem. Int. Ed. 56:13126-9).

Um das Absorptionsmaximum zu kürzeren oder längeren Wellenlängen zu verschieben, ergänzten die Forscher die Flavylium-Heterozyklen mit verschiedenen Gruppen. Sie erhielten hierdurch ein Serie von Flavyliumheptamethin-Farbstoffen mit Absorptionsmaxima zwischen 980 und 1.070 Nanometern, die sie für das SWIR-Imaging von Mäusen einsetzten.

Logik-Operationen mit Farbstoffen

Ein neuartiges Farbstoff-Konzept schuf das US-Start-up Phitonex mit der sogenannten Phiton-Plattform. Phitonex wurde 2017 von dem Computerwissenschaftler Alvin R. Lebeck und dessen Doktoranden Craig LaBoda von der Duke University in Durham, USA, gegründet.

Stellt sich natürlich die Frage: Wie kommt ein Spezialist für die Architektur von Computersystemen dazu, sich neue Fluoreszenz-Label auszudenken? Die Antwort liefert LaBodas ziemlich außergewöhnliche Doktorarbeit. In dieser versuchte er, klassische Fluorophore mithilfe des Resonanz-Energie-Transfers (RET) so zu vernetzen, dass sie logische Operationen durchführen können, wie zum Beispiel UND, ODER, NAND oder NOR, auf denen auch Computer-Schaltkreise basieren.

Für dieses Netzwerk benötigte LaBoda eine Gitterstruktur, auf der er verschiedene Fluorophore im jeweils passenden Abstand zueinander anordnen konnte. Inspiriert durch Publikationen zu DNA-Origamis kam er auf die Idee, dieses mit DNA herzustellen. Dazu mischte er zunächst ausgesuchte DNA-Einzelstränge miteinander, an die er die benötigten Fluorophore angehängt hatte. Durch Selbst-Assemblierung bildeten diese kreuzförmige Strukturen (Phitons), die sich schließlich zu einem DNA-Gitter vereinten.

Offenbar erkannten LaBoda und Lebeck schnell, dass sich die mit Fluorophoren bestückten Phitons nicht nur zur Herstellung ziemlich abgedrehter RET-Schaltkreise eigneten, sondern auch für die Produktion von Fluoreszenz-Proben. Inzwischen hat das Start-up eine bunte Palette Phiton-basierter Farbstoffe im Angebot, die von blau bis rot reicht. Zumindest im Moment lässt sich damit sicher mehr Geld verdienen als mit Logik-Schaltkreisen, die auf dem Resonanz-Energie-Transfer basieren.

Fluoreszenzfarbstoffe im Überblick pdficon


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 11/2020, Stand: Oktober 2020, alle Angaben ohne Gewähr)




Letzte Änderungen: 11.11.2020


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