Q2 EVOLVE epromo von INTEGRA

Gewinnen Sie ein limitiertes, individuell bedrucktes EVOLVE-Starterpaket mit manuellen Pipetten von INTEGRA mehr

(12.12.2023) Mikrofluidik-Systeme leiten Flüssigkeiten, Tropfen oder Zellen in Nanokanälen zu Sensoren, Reaktionskammern oder speziellen Analyseeinheiten. Inzwischen sind die Miniaturlabore aus vielen biowissenschaftlichen Geräten und Assays nicht mehr wegzudenken. Ihr größtes Potenzial könnte aber in der schnellen Vor-Ort-Analyse liegen.

Der Saal jubelt als Elisabeth Holmes 2014 an einem trüben Septembertag die Bühne der TedMed-Konferenz in Washington D.C. betritt. In ihrem schwarzen Rollkragenpulli erinnert die charismatische Dreißigjährige an den verstorbenen Apple-Gründer Steve Jobs. Die Ähnlichkeit ist gewollt. Holmes ist Gründerin sowie CEO des Biotech-Start-ups Theranos und hat mit diesem Großes vor. Den Konferenzteilnehmern erläutert sie, dass die auf mikrofluidischen Immunoassays basierende Technologie ihres Start-ups Labortests revolutionieren wird. Mit einem Tropfen Blut könne Theranos Bluttest „Edison“ bis zu 240 Krankheiten diagnostizieren. Zu den technischen Details bleibt Holmes aus gutem Grund aber sehr vage, denn Edison funktioniert nicht so, wie sie vollmundig verspricht. Tatsächlich nimmt Theranos eingeschickte Blutproben zwar entgegen – analysiert sie dann aber größtenteils auf anderen Geräten. Als sich 2015 die Zweifel an der Funktionsfähigkeit der Mikrofluidik-Plattform mehren, beginnt sich auch die US-Börsenaufsicht für das damals mit neun Milliarden Dollar bewertete Biotech-Start-Up zu interessieren. In einem von 2018 bis 2022 dauernden Verfahren wird Holmes schließlich wegen Investorenbetrug zu elf Jahren Haft verurteilt, das Unternehmen liquidiert.

Welche Pipettiertechnik passt am besten zur Anwendung?

Luftpolsterpipette oder Mehrfachdispenser – mit den Systemen von BRAND treffen Sie die richtige Wahl. mehr

Was bleibt, ist ihre Vision, verschiedene Analysen mithilfe der Mikrofluidik parallel auf kleinstem Raum und mit winzigen Probenvolumina durchführen zu können. Die Idee von Holmes war aber im Grunde nicht neu. Immerhin existierte die Mikrofluidik schon seit mehr als dreißig Jahren, als sie ihr Konzept vorstellte. Doch wie funktioniert die Mikrofluidik eigentlich und welche Rolle spielt sie ein knappes Jahrzehnt nach Holmes denkwürdigem Auftritt in den Biowissenschaften?

Die Mikrofluidik beschäftigt sich mit dem Verhalten von Flüssigkeiten in der Mikro- und Nanometer-Welt. Im Gegensatz zu den größerskaligen Systemen der Makro-Welt bestimmen hier Effekte wie Viskosität und Kapillarität das Verhalten von Flüssigkeiten, wenn sie zum Beispiel durch Kanäle mit kleinen Querschnitten strömen. Durch Mikro-Kanäle bewegen sich Fluide laminar in parallelen Schichten, ohne zu verwirbeln oder sich zu vermischen – durch große Makro-Kanäle fließen sie hingegen turbulent und mischen sich. Ob sich eine Flüssigkeit laminar oder turbulent bewegt, lässt sich anhand der Reynolds-Zahl ablesen, die nach dem britischen Physiker Osborne Reynolds benannt ist. Dabei gilt: Je kleiner die Dimensionen des Systems sind, desto niedriger ist auch die Reynolds-Zahl. Unterschreitet sie den kritischen Wert von 2.000, spricht man von einer laminaren Strömung. Auch die Kapillarkraft nimmt in kleinen Querschnitten zu und ist in mikrofluidischen Systemen oft sogar stärker als die Schwerkraft. Dieser Effekt wirkt sich direkt auf die Konstruktionsweise mikrofluidischer Apparaturen aus – wenn sich Flüssigkeiten fast unbeeinflusst von der Gravitation transportieren lassen, kann man zum Beispiel auf Pumpen verzichten.

Die Geschichte der Mikrofluidik beginnt 1965 mit einem Tintenstrahldrucker, den der Ingenieur Richard Sweet an der Stanford University in den USA konstruierte. Sweets erster funktionierender Prototyp fußte unter anderem auf den Beobachtungen des britischen Physikers John William Strutt. Bereits 1879 hatte Strutt erkannt, dass ein kontinuierlicher Flüssigkeitsstrahl immer dazu neigt, in einzelne Tröpfchen zu zerfallen. Um die Tröpfchenbildung auszulösen, wird die Tinte in Sweets Drucker durch eine 35 Mikrometer breite, vibrierende Düse gepresst. Die entstehenden Tröpfchen lädt eine Elektrode elektrisch auf, anschließend fallen sie durch ein elektrisches Feld, das sie ladungsabhängig ablenkt. Ihre Reise endet schließlich auf einem Blatt Papier, das sich unter der Düse kontinuierlich bewegt. Heute gilt Sweets „Oszillograph“ als erstes mikrofluidisches Instrument.

Etwas mehr als zehn Jahre später (1979)integrierte ein Team um den Ingenieur Stephen Terry von der Stanford University einen Miniatur-Gaschromatographen in einen Siliziumchip und hatte damit das erste „Labor auf einem Chip“ (Lab-on-a-Chip) kreiert (IEEE Trans. Electron Devices 26: 1880-86).

Zu Beginn der Neunzigerjahre tauchten dann die ersten Mikro-Totalanalyse-Systeme oder kurz µTAS auf. Das µTAS-Konzept sieht vor, alle für eine Laboranalyse notwendigen Schritte, von der Probennahme über den Transport bis zur Probenbearbeitung und -analyse, auf einem Chip zu vereinen. Auch die Separation und Detektion der Probe soll in dem geschlossenen System stattfinden.

Bereits 1993 entwickelten Forschende vom Lawrence Livermore National Laboratory sowie Roche Molecular Systems um Robert Watson Jr. einen miniaturisierten Thermocycler, der die Anforderung an ein µTAS erfüllte. Zusammen mit anderen Mikrofluidik-Geräten trug er zum Beispiel dazu bei, dass das 1990 gestartete Human Genome Project 2003 pünktlich und erfolgreich abgeschlossen werden konnte.

Die kontrollierte Herstellung feinster Tröpfchen ist auch die Grundlage der Tröpfchen-Mikrofluidik. „Ein gutes Beispiel für ein mittlerweile daraus entstandenes kommerzielles Produkt ist die digitale PCR“, sagt Andreas Morschhauser. Der Mikrosystemtechniker leitet die Gruppe „Fluidische Systeme und Technologien“ am Fraunhofer-Institut für Elektronische Nanosysteme ENAS in Chemnitz. Die Basis für die digitale PCR (dPCR) legte insbesondere ein 1992 erschienenes Paper von Pamela Syke und Co. vom Flinders Medical Center in Australien (BioTechniques 13 (3): 444-9).

Bei der dPCR wird das Gesamtvolumen des Reaktionssystems in zahllose kleine Volumina aufgeteilt. „Das geschieht meist durch einen Tröpfchen-Erzeuger, der in einer Ölphase viele tausend Wassertröpfchen generiert“, erklärt Morschhauser. Die Tröpfchen dienen als Reaktionsgefäße für die dPCR und enthalten im Idealfall nur eine oder gar keine Kopie der Ziel-DNA. In ihrer BioTechniques-Publikation zeigt die Gruppe um Sykes, dass man die Konzentration der ursprünglich vorhandenen Ziel-DNA nach der Amplifikation sehr einfach mithilfe der Poisson-Verteilung berechnen kann (siehe hierzu auch den Artikel zur Produktübersicht „Digitale PCR“ ab Seite 40). Mittlerweile wird die digitale PCR insbesondere in der klinischen Mikrobiologie und der Präzisionsmedizin eingesetzt.

Aufbauend auf der Tröpfchen-Mikrofluidik entwickelten Forschende zunehmend auch komplexere Systeme, etwa für Enzym- und Einzelzell-Antikörper-Screenings. Auch die von der Gruppe des US-amerikanischen Physikers David Weitz eingesetzte Droplet-Genomics nutzt kleine Tröpfchen für die Analyse. Das Team verwendet die Tröpfchen zum Beispiel, um aus Mikrobiom-Proben einzelne Mikroben zu selektieren und anschließend zu sequenzieren (Science 376 (6597): eabm1483).

Bei dieser sogenannten Microbe-seq-Technik ist je ein Mikroorganismus in einem Tröpfchen gefangen und wird darin lysiert. Die Tröpfchen werden in einem Gefäß aufgefangen und nach der Lyse in ein mikrofluidisches Gerät überführt. In diesem verschmelzen die mit mikrobiellen Bruchstücken gefüllten Tropfen in einem elektrischen Feld mit Tröpfchen, die alle nötigen Substanzen enthalten, um das Genom der Mikroben zu vervielfältigen. Mit der Verschmelzungstechnik werden sukzessive weitere Tropfen hinzugefügt, die Komponenten enthalten, um die vervielfältigte DNA zu zerkleinern, Adaptersequenzen hinzuzufügen und schließlich mit magnetischen Beads zu versehen. Anschließend werden die Proben zusammengeführt und sequenziert. Die Gruppe konstruierte für Microbe-seq vier verschiedene mikrofluidische Apparate und sequenzierte im Hochdurchsatz über 20.000 Einzelgenome, die sie zu 76 Speziesgenomen zusammensetzen konnte.

Mikrofluidik-Instrumente enthalten aber nicht immer geschlossene Kapillar- oder Kanal-Systeme. Ausgehend von dem Konzept der sogenannten offenen Mikrofluidik entwickelte Roland Zengerles Gruppe am Institut für Mikrosystemtechnik (IMTEK) der Albert-Ludwigs Universität Freiburg eine papierbasierte Apparatur zur Proteinelektrophorese (Electrophoresis 43: 621-31).

Das Herzstück des Elektrophorese-Geräts ist eine Cellulose-Acetat-Membran, die in einen speziellen Membranhalter eingespannt wird. Auf die Membran ist ein hantelförmiger, hydrophober Teflon-Rahmen aufgedruckt. Die Fläche innerhalb des Rahmens ist mit einem Agarose-Gel gefüllt, in das zehn Nanoliter der Proteinprobe injiziert werden. Die beiden Enden der Hantel sind mit Elektroden verbunden.

Zengerles Mannschaft gelang es, mit der Elektrophorese-Vorrichtung ein Proteingemisch, das Proteine mit Molekulargewichten von 15 bis 120 kDa enthielt, in fünfzehn Minuten aufzutrennen. Die separierten Proteine übertrug das Team direkt aus der Mikrofluidik-Apparatur auf eine PVDF-Membran und wies sie mit Antikörpern nach. „Uns ging es bei dieser Forschung darum, die ultimativ kostengünstigste Realisierung einer Apparatur für die Mikro-Kapillarelektrophorese zu finden“, betont Zengerle.

Einen anderen Ansatz verfolgt Morschhausers Gruppe. Die Chemnitzer konstruieren mikrofluidische Point-of-Care-Systeme und kooperieren dazu mit anderen Instituten und Partnern aus der Industrie. Ihre Analysetools sollen direkt an Ort und Stelle verwendet werden und unmittelbar Ergebnisse liefern. „Darin liegt meiner Ansicht nach der größte Vorteil der Mikrofluidik. In bestimmten Bereichen, wie etwa der Lebensmitteltechnik, können sie nicht lange auf Ergebnisse warten“, erklärt Morschhauser. Im Projekt hALO arbeitet sein Team zum Beispiel an einem Analyse-Tool für komplexe Flüssigproben wie Honig oder Craft-Bier.

Die darin enthaltenen Bestandteile werden von plasmonischen Sensoren detektiert. „Die Sensoren enthalten eine Goldstruktur, die mit Licht bestrahlt wird. Dadurch bildet sich auf der Oberfläche ein plasmonisches Feld“, erläutert der Mikrosystemtechniker. Das Feld resultiert aus den Schwingungen angeregter freier Elektronen in der Goldstruktur. Die Anregung der Elektronen ist stark vom Brechungsindex des Sensormaterials abhängig – sobald Moleküle auf der Oberfläche des Sensors andocken, verändert sich der Index. „Diese Änderung können wir auslesen. Die Spezifität gewährleisten wir durch Fängermoleküle, in unserem Fall Antikörper, die auf der Sensoroberfläche immobilisiert sind“, führt Morschhauser weiter aus. Der hALO-Sensor kann laut Morschhauser nicht nur Kontaminationen wie Schwermetalle detektieren, sondern auch Qualitätsparameter bestimmen, etwa die Konzentration ausgewählter Proteine. Der plasmonische Sensor wird durch ein fluoreszenzbasiertes Analysesystem für Proteine und DNA ergänzt, das mikrobielle Kontaminationen detektieren soll. Die Probenaufbereitung mithilfe von Mikrosieben findet derzeit noch außerhalb der Plattform statt, die in ihr enthaltenen Komponenten sind jedoch durch ein komplexes mikrofluidisches System miteinander verbunden. Mitte nächsten Jahres rechnet der Mikrosystemtechniker mit einem ersten Prototyp.

Point-of-Care-Systeme sind aber nicht nur in der Lebensmittelindustrie interessant, erklärt Zengerle: „Für die Betreiber von Analyselaboren liegt der große Vorteil dieser Systeme darin, dass keine ausgebildete Fachkraft nötig ist, um die Tests durchzuführen. Auch kann man auf einen zusätzlichen Raum verzichten, der etwa zum Ansetzen einer PCR in einem diagnostischen Setting benötigt wird.“ Da die Lab-on-a-Chip-Kartuschen meist in kleinen Geräten ausgewertet werden, könne man mehrere Analysen parallel durchführen. Zudem sei der Mensch als größte Quelle für Ungenauigkeiten ausgeschlossen. „Da hat sich durch COVID-19 viel bewegt. Inzwischen können auch PCR-basierte Systeme zum Nachweis des Erregers innerhalb von fünfzehn Minuten hoch reproduzierbare Ergebnisse liefern“, betont der Inhaber des Lehrstuhls für Anwendungsentwicklung am Institut für Mikrosystemtechnik (IMTEK) der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg.

Mittlerweile existieren auch erste Ansätze, 3D-gedruckte Organe mithilfe der Mikrofluidik an einen künstlichen „Blutkreislauf“ anzuschließen. Eine große Hürde sei, so Zengerle, durch die Verbesserung des 3D-Bioprintings bereits genommen. „Bei den Organ-on-a-Chip-Modellen ist die Mikrofluidik aber eher zweitrangig. Hier kommt es vor allem darauf an, zu verstehen, wie die Zellen sich selbst zu dreidimensionalen Gebilden formieren“, erläutert er. Derzeit versuchen Forschende, Muskeln, Knochen, Gehirnzellen oder andere Gewebe auf Chips aufzubringen und zu untersuchen. Allerdings bilden diese die tatsächliche Funktionalität der Gewebe oft noch nicht gut genug ab.

Noch einen Schritt weiter gehen sogenannte Human-on-a-Chip-Modelle. Von der Vision, alle wichtigen Organe eines Menschen auf einen Chip zu drucken und mittels mikrofluidischer Kanäle zusammenzuschließen, ist man zwar noch ein gutes Stück entfernt. Dennoch existieren bereits Modelle, die mehrere „Organ“-Kompartimente miteinander verbinden. So entwickelte ein internationales Forschungsteam um den koreanischen Biomechaniker Sungsu Park einen Darm-Nieren-Chip, der die Entstehung des durch Antibiotika ausgelösten hämolytisch-urämischen Syndroms im Verlauf einer Infektion mit Shigatoxin-produzierenden Escherichia coli (STEC) simuliert (Toxins (Basel) 13: 775).

Dafür kultivierten die Forschenden zunächst Nieren- und Darmzellen und säten sie anschließend in einem aus zwei Kammern bestehenden Mikrochip aus. Die beiden Kammern waren durch Kanäle verbunden und wurden kontinuierlich mit Nährmedium umspült. Gab die Gruppe STEC hinzu, starben beide Zelllinien rasch ab. Behandelte sie die Infektion mit Antibiotika, gingen die Schäden im Darm-Kompartiment zurück. Das Antibiotikum löste jedoch die Freisetzung des Shigatoxins aus, das die Nieren-Zellen auf dem Chip massiv schädigte. Mit dem System untersuchte die Forschungsgruppe, welche Antibiotika besonders häufig ein hämolytisch-urämisches Syndrom auslösen.

Forschende haben mittlerweile verschiedene ähnliche Ansätze entwickelt, die sich vor allem auf die Simulation von Krankheitsmechanismen und Therapien fokussieren. Kein Wunder, meint Morschhauser. Er sieht vor allem in der sogenannten Companion-Diagnostik Potenzial. „Man könnte sich vorstellen, dass vor Beginn einer medikamentösen Therapie mithilfe dieser Systeme geprüft werden kann, ob der Patient überhaupt auf das Medikament anspricht. Wenn ich mit einem 200-Euro-Test entscheiden kann, ob die 30.000 Euro teure Chemotherapie bei dem Patienten effektiv sein wird, ist das nicht nur für den Patienten schonender, sondern auch ökonomisch sinnvoll.“

Inzwischen ist die Mikrofluidik nicht mehr aus den Lebenswissenschaften wegzudenken, berichtet Zengerle. „Man darf nicht vergessen, dass diverse Anwendungen nicht ohne Mikrofluidik auskommen, etwa das Next Generation Sequencing.“ Die Mikrofluidik trägt insbesondere dazu bei, die Sequenzier-Plattformen zu verkleinern.

Ein Beispiel hierfür sind Nanoporen-Sequenzierer mit den Abmessungen eines überdimensionierten USB-Sticks. Für Zengerle ist die Weiterentwicklung der Nanoporen-Technologie der nächste große Schritt in der Mikrofluidik. „Mittlerweile gibt es Ansätze, mit ihr nicht nur Nukleinsäuren, sondern auch Proteine zu detektieren und zu sequenzieren. Das ist aus meiner Sicht eine faszinierende Welt, die sich da zusätzlich eröffnet.“

Nach Ansicht von Morschhauser gilt es jedoch, zunächst ein generelles Problem der Mikrofluidik zu lösen – die Vorbereitung der Proben. „Ist eine Probe komplexer, wie zum Beispiel Stuhl, oder besteht aus einem Feststoff wie Fleisch, muss sie zerkleinert und verflüssigt werden. In den kleinen Mikrofluidik-Systemen lässt sich das aber kaum bewerkstelligen. Da gibt es noch erheblichen Bedarf für innovative Lösungen.“ Bis es so weit ist, müsse die Mikrofluidik standardisiert werden, sagt er. „Jeder Hersteller kocht da sein eigenes Süppchen und die Systeme sind untereinander nicht kompatibel. Mittlerweile gibt es allerdings Bemühungen, sie besser zu standardisieren.“