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Natürliche Transformation - Kompetente Cyanobakterien

Andrea Pitzschke


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Wächst nicht einzellig, sondern in langen Fäden: Das 2010 aus Nordsee und Mittelmeer isolierte Cyanobakterium Phormidium lacuna. Foto: KIT

(01.09.2020) Natürlich kompetente Cyanobakterien nehmen fremde DNA ohne viel Federlesen auf und transportieren sie aktiv in das Zytoplasma. Bisher dachte man, dass dies nur für einzellige Cyanobakterien zutrifft, nicht aber für filamentöse.

Beim allseits angestrebten Ausstieg aus fossilen Energieträgern, der mit noch so vielen Windrädern und Photovoltaikanlagen allein wohl kaum zu schaffen sein wird, gelten auch Cyanobakterien als Hoffnungsträger. Die kleinen Photosynthese-Fabriken arbeiten unter optimalen Bedingungen ohne zusätzliche Nährstoffzufuhr tagein tagaus vor sich hin und legen dabei ordentlich an Substanz zu. Entsprechend modifiziert und in Photobioreaktoren gezüchtet, produzieren sie eine immer größer werdende Palette chemischer Verbindungen. Diese reicht von Isobutyraldehyd (Isobutanal), der Vorstufe für viele synthetische Kohlenwasserstoffverbindungen, über Ethanol bis zu dem Benzinersatz Isobutanol.

Um die Biomasse-Produktion in den Cyanobakterien in die gewünschte Richtung zu lenken, müssen sie aber zunächst genetisch manipuliert werden. Eine Grundvoraussetzung hierfür ist, dass sie sich transformieren lassen und fremde DNA aufnehmen. Das ist nicht immer ganz einfach, denn beinahe jeder Stamm hat in dieser Beziehung seine Eigenheiten. Einige Exemplare wehren Fremdgene von vornherein durch extrazelluläre Verbindungen ab oder zerstückeln die aufgenommene DNA sofort durch Nukleasen.

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Entsprechend existiert kein Transformations-Protokoll, das für alle Cyanobakterien passt. Hinzu kommt, dass Cyanobakterien zumeist mehrere Chromosomen pro Zelle besitzen. Früher oder später geht das aufgenommene Gen aufgrund der Segregation also wieder verloren. Um homozygote Transformanden zu erhalten, sind mehrere Rekultivierungs-Runden nötig, bei denen der Selektionsdruck durch steigende Antibiotika-Konzentrationen sukzessive erhöht wird.

Prinzipiell gibt es drei Methoden, Cyanobakterien zu transformieren: Elektroporation, Konjugation und natürliche Transformation. Letztere macht sich die natürliche Kompetenz von Cyanobakterien zunutze und ist der schonendste und unkomplizierteste Weg. Leider funktioniert er aber nur bei ein paar auserlesenen Stämmen. Bis vor Kurzem gingen viele Mikrobiologen sogar davon aus, dass natürliche Kompetenz bei filamentös wachsenden Vertretern nicht auftritt und nur auf einzellige Cyanobakterien beschränkt ist.

Mit Cyanobakterien fing es an

Mit diesem empirisch entstandenen Mythos räumt Tilman Lamparters Team am Botanischen Institut des Karlsruher Instituts für Technologie (KIT) auf. Seit über zwanzig Jahren hat sich Lamparter Agrobacterium-Spezies wie zum Beispiel Agrobacterium fabrum verschrieben und erforscht die Struktur und umweltabhängige Leistungsfähigkeit ihrer Phytochrome. Dennoch fing für Lamparter mit Cyanobakterien alles an: „Tatsächlich habe ich ab 1997 auch mit cyanobakteriellem Phytochrom gearbeitet, dem ersten in Bakterien entdeckten Phytochom. Die eigene Forschung ging dann aber in Richtung Agrobacterium weiter. Cyanobakterien untersuchten wir ‚nebenher‘ in Praktika und anderen Studentenprojekten, etwa in Diplom-, Bachelor- oder Masterarbeiten. Der Schwerpunkt lag hierbei immer auf Phormidium lacuna.“

Vor zehn Jahren hat Lamparters Gruppe fünf Vertreter dieses mehrzelligen, filamentösen Cyanobakteriums aus Mittelmeer und Nordsee (Helgoland) gefischt und anschließend mühevoll kultiviert und charakterisiert (Process Biochemistry, 59, B, 194-206). Lamparters Doktorand Fabien Nies entdeckte schließlich, dass Phormidium lacuna ohne zu murren Fremdgene schluckt und behält (PLoS ONE 15 (6): e0234440).

Für die Transformationsversuche setzten Nies und seine Kollegen Mario Mielke und Janko Porchert die P. -lacuna-Stämme HE10JO und HE10DO (Helgoland 2010) ein, deren Genome nahezu identisch sind. Zunächst versuchten sie, ein Kanamycin-Resistenzgen mit einem für filamentöse Cyanobakterien entwickelten Elektroporations-Protokoll in P. lacuna einzuschleusen. Das Resistenzgen war mit entsprechenden Armsequenzen ausgestattet und sollte sich via homologer Rekombination im Genom platzieren. Der anvisierte Integrationsort lag inmitten eines Hydrogenase-Gens, dessen Ausfall sich nicht weiter auf Wachstum und Entwicklung auswirken sollte, da Hydrogenasen nur unter anaeroben Bedingungen benötigt werden.

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Tilman Lamparter ist eigentlich Experte für Phytochrome von Agrobacterium-Spezies. So „nebenher“ untersuchte er auch Phormidium lacuna und entdeckte mit seiner Gruppe, dass sich diese filamentösen Cyanobakterien auf natürlichem Weg transformieren lassen. Foto: KIT

Dass die Forscher bei den Elektroporations-Versuchen eine Kontrolle mitführten, bei der sie mit DNA inkubierte Zellen direkt ausplattierten, erwies sich als Glücksfall. Denn seltsamerweise war die Transformationsrate in diesen Proben immer höher als bei der Elektroporation. Je nach Länge der homologen Sequenzen lag sie in den Kontrollen bei 67 Prozent (500 bp) sowie 94 Prozent (1.000 bp) – im Gegensatz zu jeweils 44 Prozent bei der Elektroporation. Offenbar ist die Elektroporation eher kontraproduktiv und wirkt vor allem als (teils tödlicher) Stress. Das roch nach natürlicher Kompetenz.

Nies und Co. gingen dieser Spur umgehend nach. Zunächst untersuchten sie, ob sich das Resistenzgen tatsächlich in das Genom integriert hatte und zu homozygoten Mutanten führte. Mit einer PCR und Primern, die upstream und downstream des Integrationsorts hybridisierten, konnte Lamparters Team anhand der Länge der Amplifikationsprodukte zwischen P. lacuna mit Wildtypsequenz oder integriertem Fremdgen unterscheiden.

Möglicherweise Polyploidie?

Dass in den Analysen auch beide Banden auftraten, war nicht weiter verwunderlich. Schließlich enthalten Cyanobakterien häufig mehrere Kopien ihres Chromosoms. Möglicherweise lag also auch bei P. lacuna Polyploidie vor. Aber geht‘s vielleicht auch ein bisschen genauer? Um herauszufinden, ob Phormidium lacuna-Zellen polyploid sind, schätzten Lamparters Mitarbeiter die Zahl der Chromosomen-Kopien mit einem auf dem Farbstoff DAPI basierenden Fluoreszenz-Assay ab. Laut DNA-Markierung mit DAPI und der anschließenden Fluoreszenzmessung beherbergt P. lacuna zwanzig bis neunzig Kopien des Chromosoms. Die Zahl ist vermutlich abhängig von der Wachstumsphase sowie den Kulturbedingungen, beziehungsweise in freier Wildbahn von den Umweltbedingungen.

Würde man Transformanden ohne Selektionsdruck weiterzüchten, würden sie das fremde Gen bald verlieren. Durch Subkultivierung in Gegenwart von Kanamycin verhinderten Lamparters Mitarbeiter dies und erhielten schließlich homozygote Transformanden. Je höher die Konzentration des Antibiotikums war, desto schneller verschwand die Wildtyp-Bande. Während mit 100 µg/ml Kanamycin nach vier Subkultivierungen neben dem Wunschgen noch Spuren des Wildtyps zu erkennen waren, war mit 8.300 µg/ml (das ist kein Druckfehler) ab der dritten Subkultivierung alles homozygot – und noch immer am Leben.

Die Kanamycin-Konzentration übertrifft alles, was bisher für Mikroben als verkraftbar galt, und liegt beispielsweise mehr als 150-mal so hoch wie bei E.-coli-Transformanden. Gilt dies nur für Kanamycin? Lamparter erklärt: „Wir haben Ampicillin getestet, aber noch kein entsprechendes Gen einkloniert. Das ist ein wichtiges Projekt, da auf diese Weise Doppeltransformationen möglich sind, mit denen wir testen können, ob Piline an der natürlichen Transformation beteiligt sind. Aber wir hatten noch keine Gelegenheit, dieses Experiment durchzuführen.“

Ist die natürliche Kompetenz am Ende gar nicht so selten? Dass die Transformation bei P. lacuna so gut funktionierte, könnte teils am Prozedere liegen: Die Zellsuspensionen werden homogenisiert und mehrmals in Wasser gewaschen, wodurch extrazelluläre Nukleasen und Verbindungen verschwinden, die als potenzielle Transformations-Barrieren wirken. 100 Mikroliter gewaschene, konzentrierte Zellsuspension aus einer circa sechs Tage alten Kultur werden mit 30 Mikrogramm DNA für 15 Minuten inkubiert, zwei Tage in Flüssigkultur angezogen und dann auf Normal- beziehungsweise Selektionsmedium ausplattiert. Nach zwei bis vier Wochen zeigen sich resistente Filamente auf der Platte, ähnlich einem gut bestücken Haarsieb in der Badewanne, die dann in Flüssigmedium rekultiviert werden.

Suche nach weiteren Kandidaten

Dieses technische Know-how sollte dabei helfen, weitere Cyanobakterien zu finden, die sich natürlich transformieren lassen. Grundbedingung hierfür ist jedoch, dass die Kandidaten die entsprechenden Protein-Faktoren von Haus aus mitbringen, die für den vielstufigen Transformationsprozess nötig sind. Glücklicherweise sind diese Faktoren allesamt bekannt, genauso wie die Genomsequenzen vieler Cyanobakterien. Lamparters Gruppe suchte deshalb in den Genomsequenzen nach Homologien unter den für die natürliche Transformation nötigen Protein-Faktoren. Von 29 untersuchten repräsentativen Vertretern des Stamms, darunter 14 filamentöse, bringen 19 alle benötigten Gene mit. Besonders heiße filamentöse Vertreter aus bioökonomischer und ökologischer Sicht gehören zur Gattung Spirulina beziehungsweise Trichodesmium. Versteckt sich unter diesen vielleicht ein Cyanobakterium, das mithelfen könnte, unser Energieproblem zu lösen?

„Für uns war es tatsächlich ein wichtiger Durchbruch, weil wir jetzt ähnliche Experimente mit Phormidium machen können, die bisher ausschließlich mit einzelligen Cyanobakterien durchgeführt wurden. Die US-Firma Algenol stellt zum Beispiel mit einzelligen Cyanobakterien Ethanol her. Das können wir nun auch mit Phormidium probieren“, erklärt Lamparter.

An der Kieler Uni untersucht Kirstin Gutekunsts Nachwuchsgruppe am Botanischen Institut die Expression von Hydrogenase sowie die Produktion von Wasserstoff in einzelligen Cyanobakterien. Lamparter könnte sich dies auch mit Phormidium vorstellen: „Wir wollen das alles in filamentösen Cyanobakterien probieren. Der Vorteil wäre, dass diese in Biofilmen wachsen. Dadurch könnte man das Medium einfach von den Zellen abtrennen oder schnell sauerstoffarme Bedingungen schaffen. Wenn die natürliche Transformation universeller gültig ist, könnte man zudem eine Methode entwickeln, mit der man neue Stämme schnell isolieren und mit fertigen Konstrukten ausstatten kann.“



Letzte Änderungen: 01.09.2020


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