Die Droplet-PCR wurde zwar schon vor dreißig Jahren erfunden, konnte sich aber trotz vieler überzeugter Anwender und kommerzieller Geräte gegen den Platzhirsch qPCR nie so recht durchsetzen. Für die Droplet-PCR, oder genauer Digital-Droplet-PCR (ddPCR), werden Probenansätze mit einer Wasser-Öl-Emulsion in winzige Tröpfchen zerlegt, die als unabhängige Reaktionskammern dienen. In der Emulsion gelangt nicht in jedes Tröpfchen auch ein Template-Molekül – aber nur Tröpfchen mit Template liefern nach der erfolgreichen Amplifikation ein Fluoreszenzsignal. Anhand der Zahl positiver und negativer Tröpfchen ist eine absolute Quantifizierung möglich, die im Gegensatz zur qPCR nicht von der Effizienz der Primer abhängt.
Das gilt aber nur, wenn die Tröpfchen das Prozedere der ddPCR überleben. Sie müssen beim Pipettieren mechanischem Druck standhalten und zudem auch die Temperaturzyklen überstehen. Um die Stabilität zu erhöhen, verwendet man meist fluorierte Öle und Tenside, die als oberflächenaktive Substanzen wirken.
Barium statt Calcium
Die speziellen Öle sind aber teuer und können bei Downstream-Analysen, etwa der Sequenzierung, stören. Takashi Fukudas Team am National Institute of Advanced Industrial Science and Technology in Tsukuba, Japan, kam deshalb auf die Idee, die Einzelreaktionen in einem Hydrogel zu verkapseln. Ein elastisches und thermostabiles Hydrogel entsteht, wenn eine Natriumalginat-Lösung in eine Calciumchlorid- oder Calciumcarbonat-Lösung tropft – das Polysaccharid geliert zu einer dreidimensionalen Alginstruktur, die auch als Fruchtkaviar bei Kindergeburtstagen beliebt ist. Im Gegensatz zum Kindergeburtstag ist die Extraportion Calcium bei der ddPCR aber nicht gewünscht. Die Japaner ersetzten die Calcium-Ionen daher durch Barium-Ionen, die das Gelieren ermöglichen, die Taq-Polymerase aber nicht inhibieren.
Anschließend testeten sie die Stabilität des erhaltenen Gels. Dazu verdünnten sie BaCl2 in Sojaöl auf 20 mM und tropften eine zweiprozentige Na-Alginat-Lösung in das Öl. Die hierdurch entstandenen Tropfen verformten sich nur leicht, wenn sie zwischen zwei Glasplatten gequetscht wurden.
Variable Größen
Für die ddPCR tropfte die Gruppe eine 1:1-Mischung aus der Na-Alginat-Lösung (2 %) sowie dem PCR-Ansatz in die BaCl2-Sojaöl-Lösung und vortexte die Mischung fünf Minuten, um die gewünschte Emulsion zu erhalten. Da das Gelieren direkt nach dem Kontakt mit den Barium-Ionen eintritt, bildet das Hydrogel nur eine Hülle um den Inhalt der Tröpfchen. Der PCR-Ansatz liegt im wässrigen Kern, wodurch die Diffusion der PCR-Komponenten gewährleistet ist.
Zur Auswertung der ddPCR detektierte das Team die Fluoreszenzsignale auf einer 96-Well-Platte. Die Effizienz der ddPCR war ähnlich gut wie bei der konventionellen Herstellung der Tröpfchen, aber wesentlich höher als bei der qPCR. Ganz ausgereift ist das Protokoll aber noch nicht. Die Tröpfchen sind größer als bei fluorierten Ölen und ihre Größe variiert ziemlich. Auch den Beleg, dass Downstream-Anwendungen tatsächlich problemlos möglich sind, bleiben die japanischen Forscher und Forscherinnen schuldig.
Wenn das Ziel der ddPCR aber nur ein möglichst sensitiver Nachweis ist und die absolute Quantifizierung keine Rolle spielt, sind diese Defizite unerheblich. Auch die Autofluoreszenz, die bei Sojaöl höher ist als bei fluoriertem Öl, fällt nicht ins Gewicht, weil die Fluoreszenzsignale der erfolgreichen Amplifikation viel stärker sind. Sojaöl ist zudem nicht nur tausendfach billiger als übliche fluorierte Öle – es punktet auch mit einer spezifischen Dichte von knapp einem Gramm pro Kubikzentimeter, wodurch die Hydrogel-Tröpfchen weder sinken noch aufsteigen.
Andrea Pitzschke
Tan Z. et al. (2023): Hydrogel microdroplet-based digital quantitative polymerase chain reaction. bioRxiv, DOI: 10.1101/2023.03.29.534823
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