Klonierungen können eigentlich nie schnell genug gehen. Sie sollten aber auch zuverlässig sein und zu einem klar definierten Plasmid führen. Die vor gut einem Vierteljahrhundert entwickelte Golden-Gate-Klonierung kommt diesem Anspruch ziemlich nahe (PLoS ONE, 3(11):e3647). Mit ihr lassen sich mehrere Fragmente gleichzeitig in einen Zielvektor manövrieren. Der Klonierungsansatz enthält Donorplasmide, die je ein entsprechendes Fragment liefern, einen speziellen Golden-Gate-Zielvektor, ein Typ-II-Restriktionsenzym, das etwas abseits in definierter Entfernung zum Erkennungsmotiv schneidet, sowie eine Ligase. Temperaturzyklen geben abwechselnd Nuklease und Ligase das Kommando zum Loslegen, irrtümlich religierte Fragmente erkennt die Nuklease und schneidet sie erneut. Die Fragmente arrangieren sich hierdurch neu, bis sie die gewünschte Anordnung einnehmen, die nicht mehr geschnitten wird.
Ohne Donorplasmide
Trotz ihrer Standardisierung lohnt sich der Aufwand für die Golden-Gate-Klonierung kaum, wenn man nur ein paar wenige Fragmente zusammenfügen will, oder sie überfordert ungeübte Klonierneulinge. Ileana Stoicas Gruppe von der Universität Bukarest in Rumänien hat sich deshalb ein vereinfachtes Golden-Gate-Protokoll ausgedacht, mit dem sich die Fragmente schneller zusammenfügen lassen als mit der Standardtechnik.
Das Team verwendet für die Golden-Gate-Klonierung wie üblich eine Typ-II-Nuklease (BsaI) sowie eine Ligase, verzichtet jedoch auf Donorplasmide. Im Reaktionsansatz steckt bis auf ein paar zurückbleibende Zipfelchen nur das tatsächliche zum Endprodukt verbaute DNA-Material. Die Klonierung basiert nicht auf dem klassischen Konzept von Vektor-Backbone plus Insert, sondern auf einem modular aufgebauten Vektor mit sechs Modulen. Die Module werden via PCR von Plasmiden amplifiziert, die durch eine seitengerichtete Mutation „domestiziert“ wurden und keine BsaI-Motive mehr enthalten.
Die sechs Module
Modul 1 trägt den Replikationsursprung (Ori) sowie ein Resistenz-Gen, Modul 2 bringt den Promoter mit und Modul 3 das zu exprimierende Gen. Das vierte Modul ist ein optionales MARS5-Element für die stabile Expression des Plasmids in Säugerzellen. Die beiden letzten Module beherbergen schließlich einen Terminator beziehungsweise ein Kernlokalisationssignal.
Das Team aus Bukarest hat diverse Promotoren (beispielsweise CMV mit und ohne Enhancer, SV40, PGK) sowie Terminatoren (BGH, BGA, SV40) in mehr als einem Dutzend Vektoren kombiniert und als Beispiel-Gen jeweils die für GFP codierende Sequenz verwendet. Benötigt man andere regulatorische Elemente, kann man diese mit der gleichen Strategie von anderen Plasmiden amplifizieren. Wichtig ist, dass die Primer die passenden Enden einführen. Sie sind so konzipiert, dass die PCR-Produkte nach BsaI-Verdau jeweils unterschiedliche, klar definierte Überhänge mit vier Basenpaaren tragen. Hierbei helfen die etablierten Primerdesign-Tools für Golden-Gate-Klonierungen. Die amplifizierten Module lassen sich auf Vorrat herstellen, wenn man sie in einer DNA/RNA-Shield-Lösung lagert. Da die PCR-Produkte dank der verwendeten Primer an beiden Enden ein paar zusätzliche Nukleotide tragen, müssten Exonukleasen recht weit nagen, um Schaden anzurichten.
Quick and dirty
Zunächst werden alle benötigten Module mit einer PCR amplifiziert. Statt die einzelnen Proben aufzureinigen, pipettiert man sie nach der PCR in ein einzelnes Reaktionsgefäß und extrahiert die DNA. Von 60 Mikrolitern (sechs 10-µl-PCRs) bleiben nach einer Zwischenkontrolle 20 Mikroliter Eluat übrig, die mit BsaI und der T4-DNA-Ligase versetzt werden. Nach 30 Ligations- und Restriktionszyklen (1 Minute 16°C, 1 Minute 37°C) stoppt man die beiden Enzyme durch eine Temperaturerhöhung auf 60 Grad Celsius und verdaut eventuell verbliebene Ausgangsvektoren mit DpnI. Anschließend kann man E. coli mit den Vektoren transformieren.
Zeit- und Kosteneinsparung war das oberste Gebot von Stoicas Gruppe, die sich bei ihrem „Quick-and-Dirty“-Verfahren nicht lange mit DNA-Quantifizierungen aufhielt. Ihr genügte als Zwischenkontrolle ein Agarosegel, auf dem der Klonierungsansatz vor und nach der Assemblierung parallel aufgetragen wurde. Offenbar heiligte der Zweck die Mittel, denn aus allen Klonierungen resultierten positive E.-coli-Transformanten.
Andrea Pitzschke
Cepleanu-Pascu I. et al. (2023): Easy method for six-fragment Golden Gate Assembly of modular vectors. BioTechniques, DOI: 10.2144/btn-2022-0041
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