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Translationshilfe
per CRISPR-RNAa

(24.08.2022) Fusioniert man einen Initiations-Faktor an eine tote Cas13-Nuklease, erhält man ein flexibles CRISPR-System für die Aktivierung der Translation.
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Es gibt viele Systeme, mit denen sich endogene oder eingeschleuste Gene gezielt aktivieren lassen. In der Regel erreichen sie dies durch eine gesteigerte Transkription. Eine Stufe weiter, bei der Translation, sehen die Möglichkeiten für Manipulationen dagegen noch eher mau aus. Vielleicht könnte man dazu aber auf den ein oder anderen Kniff aus der transkrip­tionellen Genaktivierung zurückgreifen.

So nutzen etwa umfrisierte CRISPR-Cas9-Systeme zur transkrip­tionellen Genaktivierung eine guide RNA, die ein „verunstaltetes“ Cas-Protein an eine passende DNA-Sequenz leitet. Verunstaltet heißt in diesem Fall, dass die Nuklease-Funktion ausgeschaltet ist und Cas als Fusions­protein mit einem Transkriptions-Regulator vorliegt. Je nach Regulator wird die Expression des Zielgens hierdurch aktiviert (CRISPRa) oder inhibiert (CRISPRi).

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Auf die Translation übertragen

Joseph Schoenigers Team an den Sandia National Laboratories in Livermore, USA, und Jennifer Doudnas Gruppe von der University of California in Berkeley kamen auf die Idee, dieses Prinzip auf die Manipulation der Translation umzumünzen. Dazu musste die Nuklease-inaktive Cas mit einem Fusions­partner ausgestattet sein, der die Translation aktiviert.

Cas13 nutzt RNA statt DNA als Substrat und es existiert auch eine deadCas13 (dCas13)-Variante ohne Nuklease-Funktion. Die Forscher suchten nach einem induzierbaren System für Bakterien, denn im Gegensatz zu Eukaryoten sind CRISPRa-Effekte in diesen enttäuschend schwach. Dazu mussten sie dCas13 mit einem Protein der bakteriellen Translations-Maschinerie fusionieren. Da die Initiation der Geschwin­digkeits-limitierende Schritt der Translation ist, kamen als Kandidaten die drei Initiations-Faktoren IF1, IF2 sowie IF3 von E. coli in Frage. Das 890 Aminosäuren (aa) lange IF2 war zu groß, blieben noch IF1 (72 aa) und IF3 (180 aa).

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Test mit zwei Plasmiden

Den Aktivierungs-Effekt der dCas13-IF-Fusionen (dCasRx) maß das Team mit einer auf einem Fluoreszenz-Signal basierenden Strategie. Dazu transformierte es einen E.-coli-Stamm, der ein durch IPTG induzierbares Rotfluores­zierendes Protein (RFP) exprimierte, mit zwei Plasmiden: Das erste enthielt ein durch Anhydro­tetracyclin (aTc)-induzierbares dCas13-IF (beziehungsweise dCas13 als Kontrolle). Das zweite exprimierte eine crRNA, die an dCas13 bindet und zudem ein 20 Nukleotide langes Motiv enthält, das die Zielsequenz des RFP-Gens erkennt.

Nach aTc-Zugabe zur Zellkultur erwartete Schoenigers Mannschaft, dass die crRNA die Zielsequenz auf dem RFP-Transkript ansteuert und dCas13-IF im Huckepack zu dieser mitnimmt. Die Translations-Initiation ist damit geschafft und es kann mit Elongation und Termination weitergehen. Dass die von der Gruppe beobachtete Fluoreszenz tatsächlich auf den IF zurück­zuführen war, zeigten Kontrollen mit dCas13 ohne den IF. Die stärkste Aktivierung beobachtete das Team mit der dCas13-IF3-Fusion.

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Optimal in Startnähe

Die US-Forscher untersuchten 36 crRNAs und stellten fest, dass die Aktivierung weitgehend positions­abhängig und sequenz­spezifisch ist. Die optimale Zielsequenz liegt in der Nähe des Transkriptions-Starts. Das gilt generell, denn ähnliche Versuche mit endogenem lacZ als Zieltranskript kamen zum selben Ergebnis. Zielt die crRNA hingegen auf die Ribosomen-Bindestelle, wirkt dies inhibierend statt aktivierend. Den Ribosomen könnte der Zugang zum Transkript erschwert sein, so die Vermutung der Kalifornier. Dass die Zellen nach der Induktion nicht nur vermehrt RFP produzierten und fluoreszierten, sondern auch höhere RFP-mRNA-Mengen aufwiesen, war etwas überraschend. Die Erklärung war aber schnell gefunden: dCas13-IF stabilisiert die mRNA – im Gegensatz zu dCas13.

Die Aktivierung durch CRISPR-RNAa kann sich sehen lassen: Unter optimalen Bedingungen erhöhte sich die RFP-Expression um den Faktor 21, die von lacZ um das 2,6-Fache im Vergleich zu den Kontrollen mit dCas13 ohne IF3.

Andrea Pitzschke

Otoupal P. et al. (2022): CRISPR-RNAa: targeted activation of translation using dCas13 fusions to translation initiation factors. Nucleic Acids Res, gkac680

Bild: Pixabay/chenspec (bearbeitet)




Letzte Änderungen: 24.08.2022