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Mit Genschere und Telefon

(21.10.2020) Ein neuer CRISPR-Cas13-basierter SARS-CoV-2-Test ist nicht nur einfach und schnell durchzuführen. Er liefert auch ein quanti­tatives Ergebnis.
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Fluoreszenz-Detektor mit Handy

Die Nuklease Cas13a schneidet RNA und lässt sich ähnlich wie Cas9 mit einer entspre­chend designten CRISPR-RNA (crRNA) zur Ziel­sequenz lotsen. Ein großes Team aus Kalifornien entwickelte auf Basis von Cas13a einen SARS-CoV-2-Nachweis, der ohne zeit­raubende reverse Transkription und Ampli­fikation auskommt. Angeführt wurde die Gruppe, der unter anderem auch die frisch­gebackene Nobelpreis­trägerin Jennifer Doudna angehörte, von der Direktorin der Gladstone Institutes of Virology in San Francisco und gebürtigen Frank­furterin Melanie Ott.

Die wichtigsten Zutaten für den Test sind neben Cas13a aus dem Stäbchen­bakterium Lepto­trichia buccalis (LbuCas13a) Zielsequenz-spezifische crRNAs, ein kommer­zielles Fluorophor-Quencher-Paar, an dem ein kurzes Stück Einzelstrang RNA (ssRNA) hängt, sowie ein Detektions­gerät, das einen einfachen Laser für die Fluoreszenz-Anregung sowie eine Handy-Kamera für die Auswertung enthält.

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Zerschnitten und zerlegt

Der Plan der Kalifornier sah vor, dass der Komplex aus crRNA und Cas13a an die SARS-CoV-2-RNA bindet, wodurch Cas13a aktiviert wird und sämtliche ssRNAs in dessen Reich­weite zerschneidet. Zu letzteren gehört auch die ssRNA des Fluorophor-Quencher-Paars. Sobald diese zerlegt ist, erscheint ein Fluoreszenz-Signal, das die Anwesen­heit der SARS-CoV-2-RNA anzeigt.

In Vorversuchen verwendete das Team zunächst verschiedene Abschnitte des in vitro transkri­bierten N-Gens von SARS-CoV-2 als Ziel-RNA. Zehn von anfangs 12 getesteten crRNAs lieferten bei diesen Experi­menten Fluoreszenz-Signale, die eindeutig über denen der RNA-freien Kontrolle lagen. Die Kalifornier konzen­trierten sich auf die zwei vielver­sprechendsten crRNAs und setzten diese zusammen ein, wodurch sich die Sensitivität deutlich erhöhte. Mit einer dritten crRNA, die gegen das E-Gen von SARS-CoV-2 gerichtet war, ließ sie sich jedoch noch weiter verbessern.

Mit diesem crRNA-Trio führte Otts Team den Test schließlich mit Nasen­abstrichen von fünf SARS-CoV-2 positiven Patienten mit unter­schiedlicher Viruslast durch. Alle fünf wurden von dem Test erkannt. Für die Test-Auswertung war die Gruppe aber noch auf einen Mikro­platten-Reader angewiesen.

Per App gesteuert

Um diesen zu umgehen, entwickelten die Forscher ein kleines Handy-gesteuertes Fluoreszenz-Mikroskop (siehe Bild). Dieses ist in eine Mini-Dunkel­kammer integriert, in der die Probe auf einer Art Objekt­träger aus dem Kunststoff PDMS aufgebracht wird. Der Strahl eines Dioden­lasers wird in der Kammer seitlich auf die Probe gelenkt, von ihr ausgehende Fluoreszenz-Signale werden von der Linse einer Handy-Kamera eingefangen. Gesteuert wird die Detektions­einheit, die handlich genug ist, um in einem Inkubator Platz zu finden, von einer App.

Neben der einfachen Hand­habung und schnellen Durch­führung des Tests innerhalb weniger Minuten sehen die Entwickler den größten Vorteil in der quanti­tativen Bestimmung der Viruslast. Damit ließe sich nicht nur das Stadium der Infektion abschätzen, sondern auch die damit einher­gehende Ansteckungs­gefahr. Die Dauer von Quarantäne-Maßnahmen könnte so wesentlich genauer festgelegt und zeitnaher überwacht werden.

Andrea Pitzschke

Fozouni P. et al. (2020): Direct detection of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas13a and a mobile phone. MedRxiv, DOI: 10.1101/2020.09.28.20201947

Bild: Fozouni P. et al.





Letzte Änderungen: 21.10.2020

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