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Kein Serum – keine Fluoreszenz

(04.12.2019) Viele Fluoreszenz-Farbstoffe fühlen sich in serum­freien Medien nicht sonderlich wohl. Proble­matisch ist dies bei Zyto­metrie-Experimenten.
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Um Zellen unter möglichst reprodu­zierbaren Bedin­gungen zu kulti­vieren, verwenden viele Forscher chemisch definierte, serum­freie Medien. Wie sich die Serum-Formu­lierungen auf die Stabilität von Fluo­reszenz-Farb­stoffen auswirken, die zum Beispiel in Fluo­reszenz-gelabelten Anti­körpern für Durch­flusszyto­metrie-Experi­mente einge­setzt werden, wurde aber bisher nicht weiter untersucht.

Ein Team um den Immuno­logen Daniel Campbell von der University of Washington School of Medicine in Seattle hat dies nach­geholt und kam zu beun­ruhigenden Ergebnissen. Die Forscher markierten für ihre Experi­mente zunächst CDF+-T-Zellen mit Fluo­reszenz-gelabelten Anti­körpern und resus­pendierten diese in einem serum­freien Medium für hämato­poetische Zellen. Anschlie­ßend maßen sie die Fluo­reszenz der markierten T-Zellen sofort im Dunkeln und nach einer fünf­minütigen Beleuch­tung in der Injektions­kammer eines Cell Sorters mit LED-Licht. Zwei der verwen­deten Farb­stoffe (CD45RA-AlexaFluor700 und CD127-PE/Cy7) wiesen nach der Beleuch­tung nur noch ein Zehntel ihrer ursprüng­lichen Fluo­reszenz-Intensität auf.

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Puffer mit und ohne Serum

Um der Sache weiter auf den Grund zu gehen, labelten Campbells Mitarbeiter mono­nukleäre Zellen des peri­pheren Blutes (PBMC) mit CD4-AF488 und dem Tandem­farbstoff CCR6-PE/Cy7. Bei Letzterem agiert PE beim Förster-Resonanz-Energie-Transfer als Donor­farbstoff, der seine Energie auf den Akzeptor Cy7 überträgt. Danach resus­pendierten sie die Zellen entweder in einem Färbe­puffer, der Kälber­serum enthielt, oder in verschie­denen serum­freien Medien und maßen anschlie­ßend die Fluo­reszenz-Inten­sität im Dunkeln. Zusätz­lich bestimmte die Gruppe auch das soge­nannte Spillover-Signal im PE-Detektor. Dieses tritt auf, wenn PE die Energie nicht auf Cy7 überträgt und sie als Fluo­reszenz-Signal im PE-Detektor landet. Ähnlich wie beim ersten Experi­ment, wurde die Fluo­reszenz-Inten­sität sowie das Spillover-Signal sofort im Dunkeln und nach einer einstün­digen Beleuch­tung mit einer Fluoreszenz­lampe gemessen.

Auch in diesem Fall war das Ergebnis eindeutig: Wurden die markierten PBMC-Zellen in serum­haltigem Puffer suspendiert, veränderten sich nach der einstün­digen Beleuch­tung weder die Fluo­reszenz-Inten­sität noch die Stärke des Spillover-Signals. Im serum­freien Medium dagegen verringerte sich die Fluo­reszenz-Inten­sität und das Spillover-Signal nahm in einigen der verwen­deten Medien deutlich zu.

Serum schützt oder stabilisiert

Theoretisch gibt es zwei Gründe, warum Fluo­reszenz-Farb­stoffe im serum­freien Medium einen großen Teil ihrer Inten­sität einbüßen: Die Zellen sterben mangels Schutz oder Kompen­sation durch das Serum. Oder das Serum hat stabili­sierende Eigen­schaften, die Fluo­reszenz-Farbstoffe vor Schäden durch Licht bewahren.

Um zwischen den zwei Möglich­keiten zu unter­scheiden, verwen­deten die Forscher Fluo­reszenz-Farb­stoff-markierte Kügelchen (Beads) anstelle von Zellen und unter­zogen diese der gleichen Beleuch­tungs- und Analyse­prozedur. Auch hier schwand die Inten­sität der Fluo­reszenz-Farb­stoffe im serum­freien Medium: Der Zerfall der Farb­stoffe tritt demnach unab­hängig von den Zellen auf.

Auf der Suche nach einer Substanz, die den Farb­stoff-Zerfall im serum­freien Medium aufhalten könnte, fiel Campbells Gruppe Vitamin C als möglicher Retter ein. Und tatsäch­lich reduzierte zuge­setztes Vitamin C (1 mM), zumindest in einem Teil der einge­setzten serum­freien Medien, den Verlust der Fluo­reszenz-Inten­sität. Aber auch Vitamin C ist keine wirkliche Lösung des Problems: Es beein­flusst unter anderem den Stoff­wechsel von Zellen und verfälscht dadurch Ergeb­nisse. Campbell und sein Team geben deshalb den einfachen Rat, bei Zyto­metrie-Experi­menten die Finger von serum­freien Medien zu lassen.

Andrea Pitzschke

Morawski P. et al. (2019): Rapid light-dependent degradation of fluorescent dyes in formulated serum-free media. BioRxiv, DOI: 10.1101/578856





Letzte Änderungen: 04.12.2019

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