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Sequenzieren mit Strichcode-Primern

(11.09.2019) NGS-Bibliotheken während der reversen Transkription einen Barcode verpassen, ist recht umständlich. Einfacher geht‘s mit der BART-Seq-Technik.
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Füttert man ein Sequen­ziergerät mit vielen unterschied­lichen DNA-Proben, so kommt als Output ein ziemliches Sequenz-Wirrwarr heraus. Um zu wissen, welche Reads von welcher Probe stammen, muss man die einzelnen Proben separat abarbeiten. Wirtschaft­licher geht es mit der Massen­abfertigung, bezie­hungsweise dem Multi­plexing. Hier befinden sich alle DNA-Proben in ein und demselben Analysetopf und werden mit Barcodes gelabelt, mit denen sich die Reads einer Probe zuordnen lassen.

Die Strichcodes werden meist mithilfe spezieller Annealing- oder Zwei-Schritt-PCR-Verfahren an die Zielse­quenzen angehängt. Aufgrund der vielen Zwischen­schritte sind jedoch große Proben-Mengen nötig und auch die Gefahr verfälschter Ergeb­nisse steigt hierdurch an. Eine wesentlich sparsamere und elegantere Barcodierungs-Technik dachten sich Micha Drukker und sein Team vom Institut für Computational Biology am Helmholtz­Zentrum München aus.

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Leichte Zuordnung

Bei ihrer „Barcode Assembly for Targeted Sequencing“ oder kurz BART-Seq-Technik sind bereits die Primer, mit denen die Zielgene amplifiziert werden, mit einem Strichcode ausgestattet. Die Barcode-Primer passen zu nicht-variablen Abschnitten ihres Zielgens: Sie sollen diese völlig unabhängig vom jeweils vorliegenden Allel binden und mit gleicher Effizienz amplifizieren können. Weiß man, welcher Barcode einst an welchem Primer hing, kann man die Amplikons nach der Sequenzierung der jeweiligen Probe zuordnen.

Forward- und Backward-Primer werden aus zwei einfachen Grund­bausteinen hergestellt: acht Nukleotide langen Barcodes mit einer angehängten zehn Nukleotide langen Adapter-Sequenz sowie genspezi­fischen reversen komple­mentären (rc) Primern, an denen ebenfalls eine zehn Nukleotide lange Adapter­sequenz hängt. Im ersten Schritt der Primer-Synthese hybridisieren die Adapter­sequenzen. Anschließend füllt ein Klenow-Fragment die Lücken bis zu den beiden Enden auf und eine danach eingesetzte Exonu­klease entfernt den reversen komple­mentären Strang (eine Schutzgruppe am Barcode-Ende verhindert, dass die Exonu­klease am falschen Ende anfängt zu knabbern). Übrig bleibt ein einsträngiger Oligo-Primer bestehend aus: Barcode (am 5'-Ende), Adapter sowie genspezi­fischer Sequenz am 3'-Ende.

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Fast alle Mutationen erkannt

Die auf diese Weise hergestellten Sets aus barcodierten Forward- und Backward-Primern setzte das Münchner Team ein, um spezifische Loci in den mit Brust- bezie­hungsweise Eierstock-Krebs assoziierten Genen BRCA1 und BRCA2 zu amplifizieren. Nach der PCR wurden alle Proben, die von 96 Patientinnen mit Brustkrebs stammten, vereint und per NGS sequenziert.

Eine von der Gruppe entwickelte freizu­gängliche Software ordnete die gelesenen Sequenzen mithilfe der Barcodes den jeweiligen Proben zu. In 95 der 96 Fälle erkannte BART-Seq die entspre­chenden Mutationen in BRCA1 und BRCA2.

Funktioniert BART-Seq vielleicht auch für Transkript-Analysen? Immerhin, so die Überlegung der Gruppe um Drukker, fallen durch die direkte Barcodierung Zwischen­schritte weg, etwa Fragmentierung, Hybridisierung oder Ligation, die bei bisherigen Barcode-basierten RNA-Analyse­verfahren Ergebnisse beein­flussen können.

Auch für Transkript-Analysen

Um dies zu klären, verwendete die Gruppe RNA aus pluri­potenten Stammzellen in unter­schiedlichen Verdünnungen sowie Spike-in-RNAs zur Normali­sierung in rBART-Seq-Experimenten. Die barcodierten Primer waren gegen Pluripotenz- sowie House­keeping-Gene gerichtet und wurden nach reverser Transkription in der PCR eingesetzt. Tatsächlich war die Korrelation zwischen der Konzentration der Template-RNA und der Anzahl der Gene-Reads sehr hoch, selbst bei winzigen Konzen­trationen im Pikogramm-Bereich: rBART-seq eignet sich also auch für Expressions­analysen.

Drukker und Co. schätzen, dass die Analyse eines mit Einzel­zellen oder genomischer DNA gefüllten Wells einer 384-Well-Platte etwa 90 Cent kostet. Und mit etwas Routine ist der BART-Seq-Prozess innerhalb von fünf Tagen zu schaffen.

Andrea Pitzschke

Uzbas F. et al. (2019): BART-Seq: cost-effective massively parallelized targeted sequencing for genomics, transcriptomics, and single-cell analysis. Genome Biology, 20:155







Letzte Änderungen: 11.09.2019

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