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Aufgemotzte Genschere

(16.01.2019) Mit der zirkulären Permutation kann man die Peptidkette in Proteinen umorga­ni­sieren. Bei Cas9 führt dies zu interes­santen Varianten.
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Die Struktur der Genschere Cas9 eignet sich nicht besonders gut für Fusionen mit funktionellen Proteindomänen oder die Steuerung des Enzyms durch zelluläre Signale. Beides wäre jedoch wünschens­wert, um die Aktivität von Cas9 besser kontrollieren zu können.

Ein Team um die CRISPR-Cas9-Pionierin Jennifer Doudna und David Savage von der University of California, Berkeley, machte deshalb Nägel mit Köpfen und veränderte die Struktur von Cas9 mit der zirkulären Permutations-Technik in die entsprechende Richtung. Die Forscher verbanden hierzu N- und C-Terminus der Cas9-Untereinheit mit verschiedenen Peptid-Linkern. Gleichzeitig zerschnippelten sie die Proteinsequenz an einer anderen Position, um neue benachbarte N- und C-terminale Enden zu erzeugen. Die Gruppe erhielt auf diese Weise verschiedene funktionelle Cas9-Varianten, mit neuen N- und C-Termini, die gut zugängliche Verknüpfungsstellen für Fusionsproteine bieten.

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Schaltbare Cas9-Varianten

Die Forscher stellten fest, dass sich die Länge des Peptid-Linkers entscheidend auf die Aktivität der modifizierten Cas9-Varianten auswirkte. Er musste mindestens zehn Aminosäuren lang sein, damit die Nuklease-Aktivität nicht verloren ging – eine größere Länge blieb jedoch ohne Auswirkung auf die Aktivität. Das brachte die Forscher auf die Idee, „schaltbare“ Cas9-Varianten herzustellen, die sich vom inaktiven in den aktiven Zustand umschalten lassen.

Die Gruppe setzte hierzu einen kurzen Peptid-Linker mit einer Protease-Sequenz ein, der das Enzym inaktiviert. Wird der Linker proteolytisch gespalten, wandelt er sich in einen offenen aktivierenden Peptid-Linker um. Bei der hieraus erhaltenen Variante ProCas9, wirkt der Peptid-Linker wie eine molekulare Sperre, welche die Aktivität von Cas9 blockiert. Die handlungsunfähige Cas9-Nuklease kann nur durch eine Protease entsperrt werden, welche die Peptidsequenz des Linkers erkennt und schneidet. Die Forscher testeten dies mit der sieben Aminosäuren langen TEV-Protease-Sequenz (ENLYFQ/S) aus dem Tobacco Etch Virus (TEV). Dieser kurze Linker reichte aus, um die Cas9-Aktivität auszuschalten. Nach Zugabe der TEV-Protease wurde sie wieder hergestellt.

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Viren-Sensor

Das Team um Doudna und Savage verknüpfte ProCas9 mit einem GFP-Reportersystem, um das System als Sensor für virale Infektionen in eukaryotischen Zellen einsetzen zu können. Der ProCas9-Sensor funktionierte nicht nur bei landwirtschaftlich interessanten Viren, wie dem zu den Potyviren zählenden Kartoffelvirus, sondern auch bei medizinisch relevanten Flaviviren, zu denen Zika-, West-Nil-, Dengue- sowie Gelbfiebervirus zählen.

Das ProCas9-System lässt sich wie eine synthetische Immunabwehr programmieren, die virale Infektionen in eukaryotischen Zellen erkennt und darauf reagiert. Hierzu wird CRISPR-ProCas9 mit guide-RNAs beladen, die auf essentielle Gene der infizierten Zelle abzielen, zum Beispiel Gene für die Replikation. Werden in diesen Genen Doppelstrang­brüche durch das aktivierte Cas9 erzeugt, führt dies unmittelbar zum Zelltod.

Durch die unendliche Vielfalt an möglichen Peptid-Linkern kann das System auf beliebige endogene oder exogene sequenzspezifische Proteasen reagieren. So könnte man es zum Beispiel als Sensor und Reporter in Signalwegen einsetzen oder für die zellspezifische Cas9-Aktivierung in Geweben oder Organen. Da ProCas9 nicht permanent aktiv ist, sinkt gleichzeitig das Risiko für Off-Target-Effekte deutlich.

Miriam Colindres

Oakes B. et al. (2019): CRISPR-Cas9 circular permutants as programmable scaffolds for genome modification. Cell, 176(1-2):254-267.e16

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Letzte Änderungen: 16.01.2019

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