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Zielgenaueres Schneiden

(25.04.2018) Der Einbau „verbrückter" Nukleinsäuren an ausgewählten Positionen der crRNA erhöht die Spezifität der Cas9-Endonuklease beim CRISPR-Cas9 Genom-Editing und vermindert unerwünschte Off-Target-Effekte.
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Schnitte an falschen Stellen durch die Genschere CRISPR-Cas9, sogenannte Off-Target-Effekte, können unerwünschte Mutationen beim Genom-Editing hervorrufen. Dies stellt nicht nur für die funktionelle Genetik ein Problem dar, sondern verhindert auch eine therapeutische Anwendung beim Menschen. Eine Gruppe um den Altersforscher Basel Hubbard von der Universität Alberta in Kanada und den Spezialisten für Einzelmolekül-Spektroskopie Seong Keun Kim von der Seoul National University entwickelte eine neue Methode, die Off-Target-Effekte sowohl in vitro als auch in Zellen minimiert.

Off-Target-Effekte hängen von der crRNA-Sequenz ab und korrelieren außerdem mit der Stabilität der Sekundärstruktur (Reißverschluss-Konformation) des Ziel-DNA(Target-DNA)-crRNA-Komplexes. Forscher entwickelten unterschiedliche Ansätze, um die Cas9-Spezifität zu verbessern. Die meisten basieren auf einer Modifikation des Cas9-Enzyms. Versuche, die Spezifität durch Veränderungen der Sequenz oder Struktur der crRNA zu verbessern, waren bisher selten.

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Stabil und resistent

Genau hier setzten Hubbard und Kim an: Die beiden hatten die Idee, "geschlossene" Nukleinsäuren, sogenannte Locked Nucleic Acids in die crRNAs einzubauen. In einem LNA-Nukleotid ist die Ribose-Einheit mit einer zusätzlichen Brücke zwischen dem 2‘-Sauerstoff und dem 4‘-Kohlenstoff verknüpft. Die Ribose wird dadurch in der 3‘-endo-Konformation fixiert und ist strukturell unflexibler als das unmodifizierte Analogon. Hierdurch wird die thermische Stabilität und auch die Basenstapelung im Vergleich zu RNA signifikant verbessert, was zu einer sehr starken Bindung an komplementäre Nukleinsäuren führt. Außerdem weisen LNAs auch eine erhöhte Nuklease-Resistenz auf. Die kanadisch-koreanische Gruppe vermutete deshalb, dass LNAs in crRNAs die Spezifität der Cas9-DNA-Spaltung verbessern und sich außerdem durch die Stabilisierung der guide RNA auch positiv auf die Effizienz auswirken sollten.

Um ihre Hypothese zu überprüfen, baute das Team neben LNAs auch sogenannte Bridged Nucleic Acids (BNAs), in die crRNAs ein, die mit einer sechsgliedrigen Brückenstruktur (2'-O,4'-Aminoethylen-Brücke) für mehr Konformationsflexibilität bei der Nukleinsäurebindung und eine größere Nukleaseresistenz durch sterische Effekte sorgen. Außerdem weisen BNAs eine geringere Toxizität als LNA-Nukleotide auf, wenn sie in Zellen eingesetzt werden.

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Deutlich weniger Mutationen

Tatsächlich verbesserte der Einbau von BNAs und LNAs an Positionen der crRNA, die typisch für Off-Target-Fehlpaarungen sind, die Spezifität der Cas9-DNA-Spaltung deutlich, ohne die erwünschte zielgerechte (On-Target-)Spaltung substanziell zu beeinflussen. Mit BNA-crRNA tauchten deutlich weniger unerwünschte Mutationen auf als bei der unmodifizierten crRNA. Und sie funktionierten auch mit gentechnisch veränderten Cas9-Varianten mit erhöhter Spezifität.

Um den zugrundeliegenden Mechanismus zu verstehen, untersuchte die Gruppe die Kinetik der Hybridisierung zwischen crRNA und Ziel(Target)-DNA beziehungsweise Off-Target-DNA mittels Einzelmolekül-FRET-Spektroskopie. Dazu markierte sie zum einen die Cas9-gebundene crRNA mit einem FRET-Farbstoff und zum anderen ein DNA-Substrat, das an eine Quarz-Oberfläche gebunden war, mit dem FRET-Gegenfarbstoff. Mit dieser Anordnung konnte die Gruppe Konformationsänderungen der sogenannten R-Schleife messen, die nach der Bindung des tracrRNA/crRNA/Cas9-Komplexes an die Ziel-DNA entsteht. Die FRET-Signalübertragung zwischen dem Farbstoffpaar während der Ausbildung der R-Schleife gibt die Übergangsdynamik zwischen teiloffenem und geschlossenen Cas9-Komplex wieder.

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Kürzere Verweildauer

Die FRET-Analyse ergab, dass die Verweildauer zwischen BNA-crRNA und Off-Target-Sequenzen, sowohl in offener als auch geschlossener Konformation, um die Hälfte kürzer war als bei der unmodifizierten crRNA. Das bedeutet, dass die BNA-RNA die dynamischen Konformations­übergänge bei der Paarung mit Off-Target-DNA beschleunigt. Die Verweilzeit in der geschlossenen Konformation (bei der die Spaltung stattfindet) ist verkürzt, wodurch die Off-Target-Spaltung ineffizienter wird.

Die Gruppe vermutete, dass diese Dynamik auch die Cas9-Enzymkinetik beeinflusst und untersuchte deshalb auch die Enzymaktivität. Ihre Experimente belegen, dass die On-Target-DNA-Spaltung mit BNA-crRNA langsamer verläuft als mit unmodifizierter crRNA, wodurch sich die Spezifität erhöht. Offensichtlich ist die verbesserte CRISPR-Cas9-Spezifität durch BNA-crRNAs auf eine verzögerte Reaktionskinetik zurückzuführen. Gleichzeitig ist auch die Fähigkeit beeinträchtigt, eine sogenannte Reißverschluss-Konformation zu bilden, die eine Voraussetzung für das Schneiden von DNA ist.

Miriam Colindres



Letzte Änderungen: 25.04.2018

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