Info

Protein-Umleitungen

(19.4.17) Mit der von Markus Affolters Gruppe am Basler Biozentrum entwickelten grabFP-Methode lassen sich Wunschproteine nicht nur präzise im Gewebe orten, sondern auch willkürlich zu „fremden“ Bestimmungsorten umleiten.

ANZEIGE

Info

Informa­tionen zu Labor­the­men wie Pipettier­tech­niken, Zell­kultur und Zen­tri­fuga­tion in Videos, Artikeln und Spielen ... mehr

editorial_bild

© Universität Basel

Für ihre Lokalisierungsversuche nutzten die Schweizer Drosophila-Flügelepithelien. Deren Imaginalscheiben bestehen aus zwei einschichtigen, ineinander übergehenden Epithelien (disc proper epithelium (DPE) und squamous peripodial epithelium). Die Forscher konzentrierten sich hierbei auf DPE-Zellen, die sich in Fliegen zu Flügeln entwickeln.

Für die GrabFP-Technik (grab Green Fluorescent Protein) muss das Wunschprotein lediglich einen GFP-tag tragen. Die zweite für die Fehllokalisation nötige Komponente sind sogenannte Nanobody-Fallen (eLife 6:e22549). Für diese standen Kamele Pate – die Nanobodies basieren auf Antikörpern der Camelid-Familie.

Kamel-Antikörper sind eine biologische Besonderheit: Ihnen fehlen leichte Ketten. Dennoch können sie über ihre N-terminale Domäne „wie ganz normale Antikörper“ an spezifische Antigene binden. So erkennt zum Beispiel der Nanobody vhhGFP4 das Grünfluoreszierende Protein (GFP). Zudem ist er auch als Fusionsprotein noch funktionstüchtig.

ANZEIGE

Info

Solide Mini-Cycler bieten große Vorteile. Kompakt gebaut und ohne bewegliche Teile meistert der MyGo viele Kilometer und Durchläufe. Im Labor und im Feld. mehr

Die Schweizer hatten bereits 2015 mithilfe von vhhGFP4 sowie CD8, einem Transmembranprotein der Maus, einen synthetischen Rezeptor konstruiert, den sie Morphotrap nannten. CD8 verankerte diesen so in der Membran, dass vhhGFP4 auf der extrazellulären Oberfläche der Zelle präsentiert wurde.

In Flügelepithelien ist CD8 gleichmäßig apikal-basolateral verteilt. Weist der GFP-Rezeptor hierbei nach außen, lassen sich sekretierte und extrazelluläre GFP-Fusionsproteine in vivo immobilisieren.

Die GrabFP-Toolbox enthält insgesamt fünf synthetische GFP-Fallen, die entweder apikal und basolateral, apikal oder ausschließlich basolateral vor Anker gehen. Für die apikal/basolaterale Verankerung sorgt eine CD8-Domäne, für die apikale eine T48/Bazooka-Domäne und für die basolaterale schließlich eine Nrv1-Domäne.

GrabFPs gibt es in den zwei Ausführungen GrabFPext und GrabFPint: Je nachdem, in welche Richtung der GFP-Rezeptor weist (extra- oder intrazellulär), kann er extrazelluläre oder cytosolische GFP-Fusionsproteine einfangen. Durch eingebaute Gal4- oder LexA-induzierbare Promotoren lässt sich das Ganze wie ein Schweizer Uhrwerk steuern.

ANZEIGE

Info

Reverse Transkription in nur 5 Minuten. Scriptase II, eine gute Idee! mehr

Die transgenen Fruchtfliegen zeigten sich ziemlich unbeeindruckt von der GrabFP-Expression. Solange sie die Falle allein, also ohne ein GFP-getaggtes Effektorprotein synthetisierten, war weder in der Fruchtbarkeit noch bei der Flügelentwicklung ein Unterschied zu ihren Wildtyp-Artgenossen zu erkennen.

Wenn sie GrabFP gemeinsam mit GFP-getaggten Morphogenen exprimierten, sah dies jedoch anders aus. Dann schnappte GrabFP die Morphogene sukzessive weg und brachte deren Verteilung entlang der apikal-basolateralen Achse durcheinander.

Tatsächlich hatte dies Auswirkungen auf die Flügelentwicklung. Wie die Schweizer herausfanden, muss das sekretierte Morphogen Decapentaplegic (Dpp) für die korrekte Musterbildung bei der Flügelentwicklung entlang der apikal-basolateralen Achse richtig verteilt sein. Mutanten lassen sich mit Dpp-Transgenen nur retten, wenn diese an die passende Stelle geleitet werden.

Für Drosophila existieren umfangreiche Sammlungen GFP-getaggter Proteine. Fliegen-Forscher, die sich von der Schweizer Studie beflügelt fühlen, können also sofort loslegen, ihre Lieblingsproteine umzuleiten. Fehlt nur noch die Kamel-Antikörperfalle.

Andrea Pitzschke

ANZEIGE

Info

Bei Carl Roth erhalten Sie Sonderpreise auf ausgewählte DURAN®-Artikel. Ist Ihr Favorit dabei? mehr

Info


Letzte Änderungen: 16.05.2017

Diese Website benutzt Cookies. Wenn SIe unsere Website benutzen, stimmen SIe damit unserer Nutzung von Cookies zu. Zur ausführlichen Datenschutzinformation