(10.11.2023) Die theoretischen Grundlagen für Konfokalmikroskope legte Marvin Lee Minsky schon in den Fünfzigerjahren. Nach schwierigem Start sind sie heute die meistgenutzten Mikroskope in biowissenschaftlichen Laboren.
Konfokalmikroskope mögen zwar nicht so im Rampenlicht stehen wie superauflösende Mikroskope, die mit scharfen Bildern von nur wenige Nanometer großen Zellstrukturen die Schlagzeilen in den Elite-Journalen beherrschen. Ihr deutlich schlechteres Auflösungsvermögen, das kaum besser ist als das klassischer Weitfeld-Mikroskope, kompensieren Konfokalmikroskope jedoch durch Vielseitigkeit und einen deutlich günstigeren Preis. Sie zählen daher noch immer zu den mit Abstand am häufigsten eingesetzten Mikroskopen in biowissenschaftlichen Laboren.
Bereits in den Fünfzigerjahren skizzierte der US-Forscher Marvin Lee Minsky an der Harvard University das Grundprinzip für ein konfokales Mikroskop, den ersten Prototyp ließ er sich 1961 patentieren. Minskys Vater war Augenarzt, und der kleine Marvin nahm regelmäßig Papis optische Geräte auseinander, die dieser dann wieder zusammensetzen musste. Sein Faible für Linsen, optische Gitter und Filter kam Minsky während seiner Postdoc-Zeit in Harvard zupass, in der der gelernte Mathematiker versuchte, die Funktion von Nervenzellen des Gehirns zu entschlüsseln. Mit den damaligen Mikroskopen war dieses Unterfangen jedoch zum Scheitern verurteilt.
Marvin Lee Minsky war Mathematiker, Computer- und Neurowissenschaftler, Vordenker der künstlichen Intelligenz am MIT Media Lab und ein hervorragender Pianist – und ganz nebenbei hat er auch noch das Konfokalmikroskop erfunden. Foto: MIT
Minsky überlegte daher, wie er den Strahlengang eines Mikroskops modifizieren musste, um kontrastreichere Bilder der Nervenzellen zu erhalten. Seine Lösung sieht auf dem Papier sehr einfach aus, war aber mit den technischen Möglichkeiten der damaligen Zeit nur sehr schwer umzusetzen. Statt die ganze Probe zu beleuchten, wie in einem üblichen WeitfeldMikroskop, wollte der Tüftler nur einen winzigen Lichtpunkt auf die Probe richten und auch nur die von diesem Punkt ausgehenden Lichtsignale detektieren. Dazu montierte er zwei Lochblenden in den von einem konkaven Reflektor einer Zirconiumlampe erzeugten Strahlengang des Mikroskops. Die erste Lochblende platzierte er exakt in der Fokusebene des Reflektor-Lichtstrahls. Nur Licht, das auf das winzige Loch fokussiert ist, passiert die Blende und wird anschließend von der Sammellinse des Objektivs in der nächsten Fokusebene gebündelt, in der es als winziger Punkt auf die hier angeordnete Probe trifft. Auf der Detektionsseite des Mikroskops wiederholt sich dieses Arrangement spiegelbildlich. Ein Objektiv fängt das von der Probe emittierte Licht ein und lenkt es auf eine Lochblende, die sich ebenfalls in der Fokusebene befindet. Der fokussierte Lichtstrahl tritt durch die Lochblende hindurch und gelangt schließlich in eine photoelektrische Zelle, die das Lichtsignal in ein elektrisches Signal umwandelt.
Die Lochblenden blockieren außerhalb der Fokusebene liegendes Streulicht und erhöhen hierdurch den Bildkontrast enorm. da sowohl die Lochblenden als auch die Probe in miteinander verbundenen Fokusebenen installiert sind, nannte Minsky diese Anordnung „con-focal”.
Mit dem konfokalen Mikroskop konnte er aber nur kleine Punkte der Probe bestrahlen. Um ein vollständiges Bild zu erhalten, musste er das Präparat schrittweise in der Fokusebene bewegen. Mit der präzisen Mechanik eines von ihm konstruierten Positioniertischs ließ sich das zwar ganz gut bewerkstelligen, das mechanische Scannen der Probe kostete aber enorm viel Zeit. Auch die schwachen Lichtquellen und die wenig empfindlichen Detektoren der damaligen Zeit verdarben Minsky letztlich den Spaß an seiner Erfindung, die bald in einem Keller seines Labors verstaubte.
Den Durchbruch für das Konfokalmikroskop brachten erst Laserlichtquellen sowie dichroitische und galvanometrische Spiegel, die ab Ende der Sechzigerjahre in optischen Geräten Einzug hielten. Die Lochblenden in Minskys Konfokalmikroskop reduzierten die Zahl der ursprünglich von der Lichtquelle ausgesandten Photonen so drastisch, dass nur noch wenige im Detektor ankamen – ein scharfes Bild ließ sich mit diesen nicht erzeugen. Das änderte sich, als lichtstarke Laser die bis dahin verwendeten Entladungslampen ersetzten. Laser liefern ein intensives kohärentes Licht mit einheitlicher Frequenz, Phase und Polarisation, das insbesondere für die heute allgegenwärtige konfokale Fluoreszenzmikroskopie unerlässlich ist.
Dichroitische Spiegel, die nur für bestimmte Wellenlängen durchlässig sind und alle anderen reflektieren, vereinfachten schließlich den Strahlengang von Konfokalmikroskopen. Sie werden hinter dem Laser in den Strahlengang eingebaut und lassen nur kürzerwelliges Anregungslicht passieren, das anschließend in das Objektiv eintritt und schließlich auf die Probe fällt. Das von der Probe emittierte längerwellige Fluoreszenzlicht nimmt den gleichen Weg in umgekehrter Richtung, wird jedoch von dem dichroitischen Filter reflektiert und auf die vor dem Detektor positionierte Lochblende gelenkt. Durch den dichroitischen Filter spart man sich das in Minskys Prototyp noch notwendige zweite Objektiv und kann Anregungs- und Emissionslicht über weite Strecken parallel durch den optischen Pfad des Mikroskops führen. Das reduziert sowohl die Komplexität des Systems als auch dessen Kosten – und erhöht zugleich die optische Präzision des Mikroskops.
Nicht minder wichtig für die Entwicklung moderner Konfokalmikroskope waren galvanometrische Spiegel (Galvospiegel), die sich von einem elektromagnetischen Feld angetrieben sehr schnell in winzigen Schritten um ihre eigene Achse drehen. In modernen Laser-Scanning-Konfokalmikroskopen sind zwei senkrecht zueinander orientierte Galvospiegel im Strahlengang des Anregungslichts positioniert, die den Laserstrahl schrittweise in x- beziehungsweise y-Richtung ablenken. Der Strahl bewegt sich hierdurch in der Fokusebene der Probe und scannt diese Punkt für Punkt.
Die Laser-Scanning-Technik ist erheblich flotter als Minskys mechanisches Verschieben der Probe, das punktförmige Abtasten kostet aber immer noch recht viel Zeit. David Egger (Yale University) und Mojmír Petráň (Charles University School of Medicine, Pilsen, Tschechische Republik) kamen daher schon Ende der Sechzigerjahre auf die Idee, die Lochblende durch eine rotierende Scheibe oder Spinning Disk mit zahllosen, spiralförmig angeordneten Löchern zu ersetzen. Fällt das Anregungslicht durch die Löcher der Spinning Disk auf die Probe, wird diese an allen beleuchteten Punkten gleichzeitig gescannt. Spinning-Disk-Konfokalmikroskope arbeiten daher noch einmal hundert- bis tausendmal schneller als Laser-Scanning-Instrumente.
Nach der ziemlich zähen Entwicklungsphase starteten Konfokalmikroskope in den Neunzigerjahren durch. Inzwischen zählen vor allem konfokale Fluoreszenzmikroskope zu den Standard-Instrumenten von Molekular-, Zell- und Entwicklungsbiologen und -biologinnen, die sie zum Beispiel in der Lebendzell-Mikroskopie für die dreidimensionale Visualisierung von Zellstrukturen einsetzen.
Die konfokale Optik lässt sich aber auch mit anderen modernen Mikroskopie-Techniken kombinieren, etwa der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM) oder der Raman-Mikroskopie. Bei FLIM detektiert das Mikroskop das Fluoreszenzsignal und misst gleichzeitig dessen Lebensdauer. Da Letztere für jedes Fluorophor charakteristisch ist, liefert sie eine zusätzliche Information, mit der sich verschiedene Fluorophore, etwa bei Multiplex-Experimenten, unterscheiden lassen. Die Fluoreszenzlebensdauer hängt aber nicht nur von der lokalen Umgebung des Fluorophors ab, etwa der Ionenkonzentration, sondern auch vom Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) durch andere Fluorophore, die sich in unmittelbarer Nähe befinden. Wird zum Beispiel Resonanzenergie von einem Donor-Fluorophor auf ein Akzeptor-Fluorophor übertragen, verkürzt sich die Fluoreszenzlebensdauer des Donors. FLIM-FRET eignet sich deshalb besonders gut, um Interaktionen von Proteinen zu visualisieren.
Mittlerweile sind neue konfokale FLIM-Mikroskope auf dem Markt, die laut Hersteller die ziemlich frickelige und bisher nur Spezialisten vorbehaltene FLIM-Mikroskopie so weit vereinfachen und automatisieren, dass sie auch für Standard-Labore zugänglich ist – sofern diese das nötige Kleingeld für die Instrumente auftreiben können.
Aus der Verbindung von Raman-Spektroskopie und Konfokalmikroskopie entstand das Konfokale Raman-Imaging, das die Wechselwirkungen von Photonen mit chemischen Bindungen für die Bildgebung ausnutzt. Der indische Physiker Chandrasekhara Venkata Raman hatte schon 1928 herausgefunden, dass Photonen Schwingungsenergie auf Moleküle übertragen können, wenn sie auf diese treffen. Da die Photonen dabei einen Teil ihrer Energie abgeben, hat das an den Molekülen inelastisch gestreute Licht eine niedrigere Frequenz beziehungsweise eine größere Wellenlänge als das eingestrahlte Licht. Die für jede Verbindung charakteristischen Frequenzverschiebungen des gestreuten Lichts kann man in Raman-Spektren aufzeichnen, die auch Aussagen zu anderen Charakteristika einer Substanz zulassen, etwa zu polymorphen Strukturen.
Konfokale Raman-Mikroskope nehmen Punkt für Punkt ein Raman-Spektrum des untersuchten Objekts auf und erstellen daraus ein dreidimensionales Bild. Ganz ähnlich wie in Minskys Prototyp wird die Probe dazu in winzigen Schritten durch den Anregungsstrahl bewegt.
Ziemlich exotisch mutet das Konfokale Brillouin-Mikroskop an, das Tatiana Sandoval-Guzmáns Gruppe an der Technischen Universität Dresden einsetzt, um die mechanischen Eigenschaften von Geweben zu untersuchen (Open Biol. 12: 220078). Es nutzt wie das Raman-Mikroskop inelastisch gestreutes Licht für die Visualisierung. Die Photonen interagieren bei der Brillouin-Mikroskopie aber nicht mit Molekülschwingungen, sondern mit sogenannten Schallteilchen beziehungsweise Phononen. Der Effekt ist aber letztendlich gleich: Die Frequenz des gestreuten Lichts ist niedriger als die des eingestrahlten Lichts. Diese sogenannte Brillouin-Frequenzverschiebung hängt von der elastischen Verformbarkeit des untersuchten Materials ab und erlaubt damit Aussagen zu dessen mechanischen Eigenschaften. Sandoval-Guzmáns Team beobachtete mit dem Konfokalen Brillouin-Mikroskop zum Beispiel, wie sich die mechanischen Parameter in den Gliedmaßen und Fingern des Axolotl (Ambystoma mexicanum) während der Entwicklung oder Regeneration veränderten. Ihre Ergebnisse zeigen, dass sich die Gewebe in der Wachstumsphase offensichtlich zunehmend weniger komprimieren lassen. Die Forschenden vermuten, dass dies auf Veränderungen in der Zusammensetzung und Struktur der extrazellulären Matrix zurückzuführen ist.
Konfokalmikroskope eignen sich auch als Do-it-yourself-Projekte. Ein Beispiel hierfür, das sich aber eher an fortgeschrittene Mikroskop-Bastler richtet, ist ein selbst gebautes Modul für ein Spinning-Disk-Konfokalmikroskop (SDCM), das Joshua Vaughans Gruppe an der University of Washington in Seattle konstruierte (Biomed. Opt. Express 13 (2): 1102-20).
Als Basis für das SDCM dient ein kommerzielles inverses Epifluoreszenz-Mikroskop, das mit mehreren Lasern bestückt ist, die das Wellenspektrum von 405 bis 750 Nanometern abdecken. Um das Epifluoreszenz-Mikroskop in ein SDCM zu verwandeln, muss man im Prinzip nur einen dichroitischen Spiegel sowie eine Spinning Disk in den Strahlengang des Anregungslichts einbauen. Als Lochscheibe verwendeten die Forschenden eine üblicherweise in der Halbleiterindustrie verwendete Photomaske, die entsprechende Hersteller auf Maß fertigen. Die Löcher ordneten sie mithilfe einer Software in Form einer Archimedischen Spirale auf der runden nur etwas mehr als zwei Millimeter dünnen Scheibe an. Jetzt fehlte nur noch ein Motor, der die Scheibe dreht. Was lag näher, als dafür einen ausgedienten Festplattenmotor zu verwenden? Das Team baute den Motor aus der Festplatte aus und steckte die Lochscheibe auf dessen Antriebsachse. Ein kleiner Mikrocontroller sorgt dafür, dass die Achse des Motors konstant mit 4.560 Umdrehungen pro Minute rotiert.
Damit waren die größten Bastelarbeiten auch schon erledigt. Ganz billig war der Umbau aber nicht. Das Team hat etwa 7.000 Euro in die zusätzlichen Komponenten des SDCM-Moduls investiert, den größten Batzen davon verschlangen der dichroitische Spiegel und zwei optische Filter. Vaughans Mannschaft setzte das DIY-SDCM für verschiedene Mikroskopie-Techniken ein, unter anderem auch für die superauflösende DNA-PAINT-Methode.
Konfokalmikroskope im Überblick
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 11/2023, Stand: Oktober 2023, alle Angaben ohne Gewähr)