Surface plasmon resonance (SPR, Oberflächenplasmonenresonanz) ist ein optisches Verfahren zur Analyse von Interaktionen zwischen Biomolekülen (Protein, DNA, RNA, etc.) in Echtzeit. Durch die hohe Genauigkeit und die Möglichkeit Proben im Hochdurchsatz zu vermessen, spielt es eine große Rolle in der Medikamentenforschung und -entwicklung.

Für die Messung wird ein Biomolekül, zumeist ein Protein, auf einem speziellen goldbeschichteten Biosensor-Chip immobilisiert (Ligand). Der potenzielle Interaktionspartner (Analyt) befindet sich in Lösung und fließt unter definierten Bedingungen über den Biosensor-Chip. Kommt es zur Bindung des Analyten an den Liganden, ändert sich die Schichtdicke des Biosensor-Chips und dadurch auch der Brechungsindex, was über eine optische Messung detektiert wird. Die Änderung des Brechungsindex ist dabei proportional zur Konzentration des gebundenen Analyten. Aus den erhobenen Daten lassen sich die Affinität und Kinetik bestimmen.

Weder Ligand noch Analyt müssen für die Messung modifiziert oder markiert werden und können direkt eingesetzt werden. Jedoch birgt die direkte Immobilisierung des Liganden einige Schwierigkeiten in sich. Wenn der Ligand direkt auf der Oberfläche angebracht wird, kann keine bestimmte Ausrichtung des Liganden vorgegeben werden. Die Interaktion mit dem Analyten wird dadurch erschwert oder ist sogar ausgeschlossen, wenn für die Interaktion essenzielle Bereiche nicht zugänglich sind. Die kovalente Kopplung, die für die direkte Immobilisation notwendig ist, kann zudem zur Änderung der Aktivität des Liganden führen. Ein weiterer Nachteil ist, dass die Regeneration des Biosensor-Chips schwierig und aufwendig ist. Zumeist sind aber mehrere Messungen notwendig, wodurch die Kosten für die Analyse schnell steigen können.

Eine Lösung bietet das Twin-Strep-tag® Capture Kit von IBA Lifesciences. Es enthält die Streptavidin-Variante Strep-Tactin®XT, welche eine hohe Affinität im niedrigen pM-Bereich für den Twin-Strep-tag® aufweist. Anstelle den Liganden direkt auf dem Biosensor-Chip zu immobilisieren wird hier zunächst Strep-Tactin®XT auf dem Biosensor-Chip aufgebracht. Der Ligand, der mit dem Twin-Strep-tag® ausgestattet ist kann nun gerichtet und stabil an Strep-Tactin®XT gebunden werden. Aufgrund der geringen Größe des Twin-Strep-tag® (28 aa, 2,8 kDa) und der milden Reinigungsbedingungen, die das Strep-tag®-Protein-Reinigungssystem bietet, bleibt auch die natürliche Aktivität des Liganden erhalten. Neben den notwendigen Substanzen für die Immobilisation von Strep-Tactin®XT an den Biosensor-Chip, enthält das Kit auch einen Regenerationspuffer. Dadurch kann direkt nach der Messung der Biosensor-Chip regeneriert werden, wobei nur der getaggte Ligand entfernt wird, das Strep-Tactin®XT aber erhalten bleibt. Somit kann nach der Regeneration gleich die nächste Messung vorgenommen werden.

Besonders in der Antikörperentwicklung gegen ein bestimmtes Target ist es wichtig, dass auch Interaktionen mit einer sehr hohen Affinität und langsamer Dissoziationsrate gemessen werden können. Dafür ist eine feste Immobilisation des Liganden an den Biosensor-Chip notwendig. Kann die indirekte Immobilisation des Liganden nur mit einer moderaten Affinität erfolgen, wie zum Beispiel beim His-tag zum NTA, dann können diese Affinitäts-Tags nicht verwendet werden, da die Interaktion selbst zu schwach und störanfällig ist. Strep-Tactin®XT und der Twin-Strep-tag® hingegen formen einen sehr starken Komplex mit einer Halbwertszeit von 13 h. Durch diese starke Affinität können auch Interaktionen mit langsamen Dissoziationsraten gemessen werden. Zudem ist die Interaktion von Strep-Tactin®XT und dem Twin-Strep-tag® auch sehr spezifisch, wodurch unspezifische Bindungen sehr unwahrscheinlich sind und komplexe Proben, wie Zellkulturüberstände, direkt analysiert werden können.

Einen ähnlich starken Komplex wie Strep-Tactin®XT und der Twin-Strep-tag® bildet der biotinylierte Avi-tag mit Streptavidin. Aufgrund der hohen Affinität war die Kombination aus Avi-tag und Streptavidin lange Zeit der Goldstandard für die Medikamentenforschung und -entwicklung. Drei wesentliche Nachteile des Systems sind jedoch die fehlende Regenerierbarkeit der Biosensor-Chips, die aufwendige und ungleichmäßige Biotinylierung sowie die unzureichende Eignung des Avi-tags für die vorhergehende, notwendige Proteinreinigung des Liganden. Proteinreinigungssysteme für den Avi-tag führen nur zu sehr geringen Proteinausbeuten und weisen zudem einen hohen Preis auf. Um eine ausreichend hohe Proteinmenge zu erhalten, ist deshalb der Einsatz eines weiteren Affinitäts-Tags notwendig. Jedoch ist die weitere Modifikation des Liganden kritisch, da die spätere Interaktion mit dem Analyten gestört werden kann. Mit Strep-Tactin®XT und dem Twin-Strep-tag® können Liganden schnell und einfach in hoher Reinheit und Ausbeute gereinigt werden. Keine weiteren Modifikationen, wie zusätzliche Affinitäts-Tags für die Reinigung oder Biotinylierung sind notwendig. Strep-Tactin®XT und der Twin-Strep-tag® haben die gleichen Vorzüge wie Avi-tag und Streptavidin und können zusätzlich noch durch eine kostengünstigere Reinigung, direkte Einsetzbarkeit für SPR sowie einfache Regenerierbarkeit der Biosensor-Chips aufwarten und werden dadurch zum neuen Goldstandard.

Wesentliche Vorteile:

• Durch die indirekte Immobilisation muss der Ligand nicht chemisch modifiziert werden, wodurch er seine natürlichen Eigenschaften beibehält.
• Die hohe Affinität im pM-Bereich zwischen Strep-Tactin®XT und Twin-Strep-tag® ermöglicht Messungen über lange Zeiträume – die Halbwertszeit beträgt 13 h.
• Kosten können gespart werden, da der Biosensor-Chip durch einen einfachen Regenerationsschritt mehrfach und direkt wiederverwendet werden kann, ohne dass Strep-Tactin®XT erneut aufgebracht werden muss.
• Aufgrund der spezifischen und starken Interaktion zwischen Strep-Tactin®XT und Twin-Strep-tag® können für die Analyse komplexe Proben wie Zellkulturüberstand verwendet werden.
• Ein System für alles – sowohl Reinigung des Liganden als auch SPR-Analyse können unkompliziert mit der Strep-tag® Technologie erfolgen.

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