Amine haben viele Gesichter. In der Natur findet man einfach gestrickte Amine, beispielsweise Glycin, genauso wie äußerst komplizierte, wie das halluzinogene Mescalin. Im Gehirn werden Spuren bestimmter Amine mit der Alzheimer-Erkrankung in Verbindung gebracht (Neural Regen Res, 16(7): 1394–6); Aminverbindungen sind aber auch in Medikamenten sehr häufig vertreten (siehe „Amines“ in der Drugbank).
Entsprechend begehrt sind Strategien, mit denen sich Amine verändern, biosynthetisch in größeren Mengen gewinnen oder gezielt abbauen lassen. Die hierzu benötigten Amin-umwandelnden Enzyme sind genauso vielfältig wie ihre Substrate. Und sie haben ein Alleinstellungsmerkmal, das nicht nur für die Wirkstoffforschung interessant ist – im Gegensatz zu den meisten chemischen Synthesen generieren sie stereoselektiv chirale Amine.
Konzept mit E. coli
Uwe Bornscheuers Team an der Universität Greifswald entwickelte ein einfaches, für den Hochdurchsatz geeignetes Konzept, mit dem man Amin-bildende oder Amin-umwandelnde Enzyme selektionieren und optimieren kann. Dazu kultivierte die Gruppe E. coli auf einem Minimalmedium, auf dem nur Zellen wachsen können, die ein gewünschtes Amin-modulierendes Enzym exprimieren. Nur diese Zellen sind imstande, die einzig verfügbare Stickstoffquelle zu mobilisieren.
Als Testobjekte für das System dienten dem Team jeweils eine Transaminase aus der Enzymklasse EC 2, eine Monoamin-Oxidase (MOA) aus der Enzymklasse EC 1 sowie eine Ammonium-Lyase als Vertreterin der Klasse EC 4. Die Transaminase wandelt ihr Substrat (Ziel-Amin) mithilfe des Co-Substrats Pyruvat in L- oder D-Alanin um. Bakterienzellen, die das Ziel-Amin nicht verwerten können, wachsen auf einem chemisch definierten M9-Medium nicht, welches nur dieses Amin als Stickstoffquelle enthält – denn ihnen fehlt Alanin als einzige und leicht verwertbare Stickstoffquelle. Transformierte Zellen, die ein Transaminase-Konstrukt tragen, haben je nach Expressionsstärke und spezifischer Enzymaktivität hingegen reelle Überlebenschancen. Die entsprechenden Klone erscheinen nach dem Ausplattieren der Transformationsansätze als Kolonien auf dem M9-Medium.
Ähnliches Spiel
Bei der Monoamin-Oxidase läuft das Spiel ganz ähnlich ab. Sie überführt ihr Substrat in ein Imin und wandelt dabei Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid um. Das Imin dient Bakterienklonen, die eine aktive Monoamin-Oxidase synthetisieren, als Stickstoffquelle, denn es durchläuft eine Autohydrolyse und reagiert mit Wasser zu einer Ketoverbindung sowie Ammoniak. Die Ammonium-Lyase katalysiert schließlich die reversible Konversion einer ungesättigten Fettsäure zu dem Ziel-Amin sowie Ammoniak. An die Stickstoffquelle kommen auch hier nur Zellen heran, die die Ammonium-Lyase exprimieren.
Die stereoselektiven Enzyme können eine chirale Form [(S)- oder (R)-Enantiomer] aus einem Razemat beseitigen, sodass nur die gewünschte Form übrigbleibt. Um möglichst effektive Enzyme zu erhalten, nutzten die Greifswalder den E.-coli-Stamm BL21(D3), der nur mit sehr wenigen Stickstoffverbindungen etwas anfangen kann. Die Zellen transformierten sie mit einer Bibliothek von Expressions-Konstrukten für die Amin-umwandelnden Enzyme, die von unterschiedlich starken Promotoren angetrieben wurden. Durch Zufallsmutationen oder gezielte Mutagenese, beispielsweise an einzelnen Aminosäuren im aktiven Zentrum, lagen die für die Enzyme codierenden Gene in vielen Varianten vor.
Evolution in zwei Runden
Den starken Promotor nutzte die Gruppe, um zunächst Klone mit aktiven Enzym-Varianten zu finden. In der zweiten Evolutionsrunde diente diese Variante als Ausgangspunkt für die Expression mit einen schwächeren Promotor. Die hierdurch selektionierten Klone enthielten schwach exprimierte aber sehr aktive Enzym-Varianten.
Die besten Kandidaten selektionierte das Team, indem sie die Bibliothek mit den Transformanten direkt auf M9-Agarplatten ausstrich oder erst in M9-Flüssigmedium anreicherte und danach auf LB ausplattierte. Anschließend sequenzierten die Greifswalder die Klone und maßen die Aktivität der isolierten Enzyme. Im Gegensatz zu anderen Evolutions-basierten Strategien genügen für das Verfahren ein bis zwei Selektionsrunden.
Die Forscher und Forscherinnen nutzten die Technik beispielsweise, um eine Cyclohexylamin-Oxidase von Brevibacterium oxydans zu selektionieren. Mit dieser stellten sie anschließend in einer Derazemisierungs-Reaktion eine chirale Amin-Vorstufe des Medikaments Cinacalcet her. Eine zusätzlich exprimierte Katalase verhinderte, dass das von dem Enzym produzierte Wasserstoffperoxid für die Zellen zur Gefahr wurde.
Andrea Pitzschke
Wu S. et al. (2022): A growth selection system for the directed evolution of amine-forming or converting enzymes. Nature Communications, 13:7458
Bild: Wu et al.
