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Auf dem Weg zu Massentests (1)

(24.08.2020) Für den Nachweis von SARS-CoV-2 entwickeln Forscher immer mehr Methoden, die schneller, einfacher und vor allem Hochdurchsatz-geeignet sind.
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Die meisten der dreihundert kommer­ziellen Nachweis­systeme zur direkten Detektion von SARS-CoV-2 bestätigen COVID-19-Fälle auf ähnliche Weise (siehe „SARS-CoV-2 Diagnostic Pipeline“): Die virale RNA wird aus respira­torischen Proben extrahiert, die entweder aus den oberen Atem­wegen als Rachen­abstrich oder aus den unteren Atemwegen als Luftröhren­spülung, Sputum oder Tracheal­sekret entnommen wurden. Anschließend wird die konservierte Region des viralen RNA-Genoms mittels reverse Transkriptase (RT)-quantitativer (q) Echtzeit-PCR (RT-qPCR) detektiert.

Das Detektions­limit dieser Tests liegt zwischen zwei bis dreißig Sequenz­kopien pro Mikroliter PCR-Reaktion (J Clin Virol, DOI: 10.1016/j.jcv.2020.104433). Entsprechend gelingt der SARS-CoV-2-Nachweis mit der RT-qPCR etwa drei Tage vor und bis zu einem Monat nach Beginn der ersten COVID-19-Symptome. Als Ziel­sequenzen dienen die codierenden Gene für die Proteine Spike (S), Nukleo­kapsid (N), Envelope (E) und RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp) sowie der offene Leserahmen ORF1a/b von SARS-CoV-2. Für den Nachweis sollten wenigstens zwei Genom­sequenzen von Corona­viren gefunden werden, von denen mindestens eine spezifisch für SARS-CoV-2 ist. Ähnliche Nachweis­systeme, zum Beispiel für Influenza­viren, existieren im klinischen Alltag seit Jahren.

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Bis Mitte Juli 2020 wurden weltweit über 280 Millionen SARS-CoV-2-Verdachts­fälle mit der RT-qPCR getestet. Die meisten der hierzu nötigen Arbeits­schritte mussten von geschulten Fachkräften durch­geführt werden, die hundert­tausende Proben auswerteten. RT-qPCR-Reagenzien und qPCR-Thermocycler erreichten schnell ihre Kapazitäts­grenzen. Es zeigte sich, dass weder die Kosten, die das Bundes­gesundheits­ministerium auf 39,40 Euro pro qPCR-Test taxiert, noch ihr Zeitaufwand auf pandemische Größen­ordnungen hoch­skalierbar sind. Herkömmliche Nachweis­systeme realisieren nur einen Bruchteil der in Zeiten von SARS-CoV-2 notwendigen Amplifi­kations- und Sequenzier­kapazitäten.

Um die Komplexität der RT-qPCR zu umgehen, kombi­nierten die Zellbiologen um Christian Kaltschmidt an der Universität Bielefeld einen sogenannten Nextgen-Thermocycler mit einer Fluoreszenz-basierten Endpunkt-Messung SARS-CoV-2-spezifischer PCR-Produkte. Der Nextgen-Thermocycler erhitzt PCR-Ansätze auf einer Poly­propylen-Folie zwischen Alublöcken, ist also extrem schnell im Vergleich zu klassischen Peltier-basierten PCR-Maschinen. Den Nachweis der E- und N-Gene von SARS-CoV-2 in Rachen­abstrichen erledigen die Bielefelder mit ihrer Technik innerhalb von dreißig Minuten (MedRxiv, DOI: 10.1101/2020.06.25.20137398v1).

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Schneller als die Polymerase

Noch schneller ist der mikro­fluidische Extreme Cycler von Carl Wittwer, Erfinder des LightCyclers und inzwischen Professor Emeritus an der University of Utah: Der PCR-Zyklus einer kurzen Sequenz unter hundert Nukleotiden dauert nur noch weniger als eine Sekunde (Biomol Detect Quantif, 17:100081). Geschwin­digkeits-limitierend sind nicht länger die Heiz- und Kühlraten der PCR-Geräte, sondern die Exten­sionsraten der DNA-Polymerasen. Für den schnellen SARS-CoV-2-Nachweis ist solch ein Mikro­fluidik-System natürlich wie geschaffen.

Das wissen Wittwers ehemalige Mitarbeiter wie etwa Jared S. Farrar an der Virginia Common­wealth University am besten und kombinieren die Extreme-PCR mit einer optimierten RNA-Extraktion. Von Abstrich bis zum Ergebnis dauert ihr SARS-CoV-2-Test angeblich nur dreieinhalb Minuten. Noch können sich Routine­labore aber nicht selbst davon überzeugen, da eine Publikation sowie die behördliche Zulassung bisher ausstehen.

Die größte Konkurrenz der RT-qPCR im SARS-CoV-2-Nachweis-Wettrennen sind Spielarten der Schleifen-vermittelten iso­thermalen Ampli­fikation (LAMP). Das Herzstück von LAMP bildet die DNA-Polymerase aus dem Bakterio­phagen φ29 oder die in silico konstruierten Homologen der Bacillus stearo­thermophilus-DNA-Polymerase. Dank der strang­versetzenden Aktivität dieser Polymerasen entfallen bei LAMP jegliche Heiz- und Kühlschritte. Dadurch ist sie schneller als die qPCR und liefert Ergebnisse binnen Minuten. Darüber hinaus kommt LAMP ohne teure PCR-Cycler aus – die Technik funktioniert isothermal selbst in einfachen Heizgeräten, etwa einem Küchenofen.

Etliche kolori­metrische RT-LAMP-Verfahren werden zur SARS-CoV-2- Diagnose bereits an Patienten getestet. Das Home-Dip-RT-LAMP-Protokoll von Max Kellner, Andrea Pauli und Julius Brennecke vom Wiener BioCenter beispiels­weise erlaubt einen Virus­nachweis aus Nasen­höhlen-Abstrichen oder Gurgel­proben binnen Minuten selbst in den eigenen vier Wänden und ohne jegliche Labor­ausstattung (siehe hierzu LJ Online „Wiener Virustest – auch für zuhause“ vom 08.07.2020). Da das Wiener Verfahren virale RNA auf einem Zellulose­streifen nachweist, ist die Skalierung jedoch eine Heraus­forderung (BioRxiv, DOI: 10.1101/2020.06.23.166397).

Egal welches Detektions­format letztendlich zum Einsatz kommt, gegen­wärtige Pandemie­strategien vertrauen der Testung von COVID-19-Verdachtsfällen. Von einer Untersuchung asympto­matischer Personen rät das Robert-Koch-Institut ab, da bei negativem PCR-Nachweis eine Infektion mit SARS-CoV-2 nicht ausgeschlossen werden kann. Selbst mit allen verfügbaren Nachweis-Kits wäre es zudem kaum möglich, die Ausbreitung von SARS-CoV-2 in der Bevölkerung unabhängig von COVID-19-Symptomen nachzu­verfolgen.

Neue Pooling-Strategien

Eine relativ einfache Möglichkeit, die Probenkapazität zu erhöhen und Tests zu beschleunigen, sind Sammelproben (Pooling-Verfahren). Am 18. Juli 2020 segnete die US-amerikanische Arznei­mittelbehörde (FDA) erstmals einen diag­nostischen SARS-CoV-2-Test von Sammel­proben ab. Auf den ersten Blick sieht das neue Testverfahren, das der US-amerikanische Diagnostik-Riese Quest Diagnostics einsetzt, nur nach Arbeits­erleichterung aus. Doch es öffnet die Tür zur zeitgleichen Testung ganzer Bevölkerungs­gruppen. Vor allem aber ermöglicht es, die SARS-CoV-2-Pandemie ohne Vakzine zu überwinden.

Was ist also der Vorteil von Quest Diagnostics‘ Teststrategie? Ihr SARS-CoV-2-RT-qPCR-Test darf Abstriche von bis zu vier Personen im selben Röhrchen analysieren. Dieser Sammel­ansatz punktet in Gegenden geringer Durch­seuchung, in denen ein positives Testergebnis nur selten die getrennte Analyse der vier Proben erfordert. So spart der Assay Dreiviertel an Chemikalien, Personal und Zeit ein. In Zeiten einer Ressourcen­verknappung ist das ein entscheidender Vorteil, der auf die meisten Testformate übertragen werden kann.

Bereits im März 2020 wiesen Nasa Sinnott-Armstrong (Stanford University), Daniel L. Klein (Oracle Corporation) und Brendan Hickey (Google Inc.) auf das Potenzial von Gruppentests zur Bekämpfung von SARS-CoV-2 hin (MedRxiv, DOI: 10.1101/2020.03.27.20043968v1). Abhängig von der Virus-Verbreitung und der Skalierung von Einzeltests auf 4-, 96- oder 384-Well-Mikro­platten reduzieren Sammel­proben die Anzahl notwendiger Tests auf bis zu ein Achtel. Ein interaktives Web-Tool zu ihrer Pooling-Strategie verdeutlicht eines ganz klar: Skalier­barkeit ist das Alpha und Omega Pandemie-tauglicher Diagnostik­verfahren.

Auch verschiedene deutsche Gruppen und Diagnostik­labore experi­mentieren mit Sammelproben (siehe hierzu auch Laborjournal 5/2020, Seite 62). Jüngstes Beispiel ist die Leipziger Arbeitsgruppe von Svante Pääbo, dem Begründer der Paläogenetik: Über mehrere Wochen testeten die Wahl-Leipziger täglich die Mund­spülungen von zweihundert Bewohnern und Mitarbeitern eines Pflegeheims auf Coronaviren. Selbst in Ein-Mikroliter-Aliquots von Zehn-Milliliter-Gurgel­proben konnten sie SARS-CoV-2 mittels RT-qPCR detektieren. Der Nachweis gelang ihnen ebenfalls in Sammelproben von bis zu 26 Personen (MedRxiv, DOI: 10.1101/2020.06.24.20139501v1).

Pääbos Protokoll bietet eine Reihe von Vorteilen: Im Hoch­durchsatz-Screening kostet der Test unter vier Euro pro Probe. Gurgel­proben können ohne medizinisches Fachpersonal bereit­gestellt werden. Knapp fünfzig Institutionen in der Größen­ordnung des oben erwähnten Pflegeheims können auf einer 96-Well-Mikrotiterplate in neunzig Minuten für dreihundert Euro getestet werden. Inklusive Transport und Evaluierung vergehen weniger als fünf Stunden, bis die Resultate am Ort der Proben­entnahme zur Verfügung stehen.

Eine periodische Testung weiter Kreise der Bevölkerung scheint also machbar. Hans Lehrach, emeritierter Direktor des Berliner MPI für molekulare Genetik und einer der Pioniere in der Entwicklung von Genom­analyse-Techniken, geht noch weiter: „Die popu­lationsweite Testung und Quarantäne Infizierter und eventueller Test­verweigerer könnte es uns ermöglichen, SARS-CoV-2 in kurzer Zeit zu eliminieren, und zwar für einen vergleichs­weise trivialen Betrag im Vergleich zu den medizinischen und wirtschaft­lichen Verlusten durch die SARS-CoV-2-Pandemie. Die Entwicklung eines Impfstoffs, die nicht notwen­digerweise Erfolg haben muss, wird mit unglaublichem finanziellen Einsatz weltweit verfolgt. Die weniger riskante Möglichkeit popu­lationsweiter Tests wird von den politischen Entschei­dungsträgern weitest­gehend ignoriert. Bisher hat sich die Bundes­regierung nicht für diese Möglichkeit interessiert.“

Deshalb erarbeitet Lehrach in Kooperation mit George Church, dem Initiator des Personal Genome Project und Direktor am NIH Center for Excellence in Genomic Science, wie Amplifi­kations- und Sequen­zierungs-Techniken zusammen mit Kontakt­verfolgungs­ansätzen vor zukünftigen Pandemien schützen können. Ihr Ziel ist es, landesweite Infra­strukturen zu errichten, mit denen Bevölkerungs­gruppen unabhängig von ihrem Symptom- und Kontakt­status regelmäßig auf Pathogene wie SARS-CoV-2 getestet werden könnten. Denn nur ein Mangel an Wirten kann pathogene Viren und Bakterien ausrotten. Wie diese Mammut­aufgabe zu bewältigen ist, beschreiben sie in ihrem White Paper „Der Ausweg aus der Pandemie“.

Keine Utopie mehr

Möglich wäre der Test ganzer Bevölkerungs­gruppen mit dem von Jonathan L. Schmid-Burgk in Feng Zhangs Team am Broad Institute entwickelten LAMP-Seq-Verfahren, das die isothermale Ampli­fikation mit der Short-read-Next-Generation-Sequen­zierung kombiniert (siehe hierzu auch das Interview mit Schmid-Burgk, welches wir morgen an dieser Stelle veröffent­lichen werden). LAMP-Seq erweitert die RT-LAMP-Reaktion von Abstrich­proben mit SARS-CoV-2-spezifischen Primern um individuelle Nukleotid­sequenzen, die als Barcodes dienen. Die markierten Proben werden vereinigt und können ressourcen­schonend mittels PCR amplifiziert und danach sequenziert werden. Verwechs­lungen von Proben im gemeinsamen PCR-Gefäß aufgrund von Sequenzier­fehlern verhindern speziell designte Barcode-Sequenzen. Mit einem 75 Zyklen umfassenden Sequen­zierlauf können laut Schmid-Burgk, der seit Juni 2020 eine Arbeitsgruppe am Bonner Institut für Klinische Chemie und Pharma­kologie leitet, an einem halben Tag bis zu 100.000 Proben getestet werden (BioRxiv, doi: 10.1101/2020.04.06.025635v2).

Einen ähnlichen Ansatz verfolgt auch der englische Hersteller von Nanoporen-Sequen­zierern Oxford Nanopore. Das LamPORE-Verfahren der Engländer kombiniert LAMP mit der Nanoporen-Sequen­zierung. Nach Angaben der Firma können mit LamPORE in vier Stunden bis zu 1.152 Proben auf der portablen MinION-Durch­flusszelle sequenziert werden. Oxford Nanopores Benchtop-Sequenzier­maschine GridION schafft in der gleichen Zeit sogar 5.760 Proben. Noch ist LamPORE aber nicht behördlich zugelassen.

Henrik Müller

Dieser Artikel ist eine Online-Vorab-Veröffent­lichung aus dem demnächst erscheinenden Laborjournal-Heft, Ausgabe 9-2020.

Foto: Universität Bielefeld/M.-D. Müller



Letzte Änderungen: 24.08.2020

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