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Reihenuntersuchung
Produktübersicht: Protein-Microarrays

Protein-Microarrays

Lange Zeit beneideten Proteomiker ihre Kollegen von der DNA-Front um deren DNA-Microarrays. Mittlerweile müssen aber auch Proteomiker nicht mehr auf Arrays verzichten.

Ganz so einfach wie bei DNA-Chips funktioniert die Herstellung von Protein-Microarrays jedoch nicht. Proteine sind wesentlich sensibler und anspruchsvoller als cDNA-Fragmente oder Oligonukleotide, die es mit stoischer Gelassenheit ertragen, wenn sie aus der Düse eines Microarray-Druckers herausfliegen, anschließend auf die Oberfläche eines Glasplättchens knallen und auf dieser von elektrostatischen Kräften festgezurrt werden.

Proteine nehmen eine solch raue Behandlung schnell krumm und enden dann als funktionslose Klumpen, mit denen der Proteomiker nichts mehr anfangen kann. Die Hersteller und Entwickler von Protein­-Microarrays investieren deshalb viel Hirnschmalz in die Gestaltung der Oberflächenstrukturen von Protein-Microarray-Trägern (Slides). Idealerweise sollte diese keine nichtspezifischen Substanzen adsorbieren, die Bindung von spezifischen Substanzen an funktionelle Gruppen der immobilisierten Proteine nicht behindern und auch deren dreidimensionale Struktur nicht verändern.


Große Oberfläche

Diese Anforderungen lassen sich, mehr oder weniger eingeschränkt, mit verschiedenen Trägerbeschichtungen erreichen. Die derzeit gängigste dürfte die Beschichtung von Protein-Microarray-Slides mit Nitrocellulose sein. Letztere nutzen Biochemiker schon seit Jahrzehnten, wenn sie Westernblots und andere Proteinnachweise auf Nitrocellulose-Membranen ausführen. An der großen, schwammartigen Oberfläche der Nitrocellulose-Blotmembran können Proteine oder Antikörper anhaften, ohne dabei ihre Bindungseigenschaften, zum Beispiel für andere Proteine, zu verändern oder zu verlieren. Das gleiche Prinzip nutzt man auch bei Nitrocellulose Slides für Protein-Microarrays. Wie bei Blotmembranen vermitteln auf diesen hydrophobe Wechselwirkungen die nichtkovalente Bindung der Proteine an die Nitrocelluloseoberfläche.


Ungeordnete Proteine

Proteine lassen sich aber auch über kovalente Bindungen auf Objektträgern fixieren. Dazu überzieht man die Oberfläche mit einer Silanbeschichtung, die reaktive Aldehyd- oder Epoxy-Gruppen enthält, an die Proteine (etwa über Schiff-Basen) kovalent binden können. Unabhängig davon ob die Proteine kovalent oder nicht-kovalent gebunden werden, bleibt bei diesen Verfahren jedoch ein Problem weiterhin bestehen: die Proteine richten sich auf der Oberfläche des Trägers zufällig aus ohne eine bevorzugte Richtung einzuhalten. So kann es durchaus passieren, dass aktive Zentren, Epitope oder Domänen der immobilisierten Proteine oder Antikörper (oder zumindest einer Teilpopulation davon) verdeckt bleiben und für die Proben oder Testsubstanzen nicht oder nur eingeschränkt zugänglich sind.

Aber auch für dieses Problem haben clevere Biochemiker inzwischen Lösungen entwickelt. So kann man zum Beispiel die Kohlenhydratreste in der konstanten Region (Fc-Region) von Antikörpern biotinylieren, so dass die Antikörper immer in der gleichen Orientierung auf einem Streptavidin-beschichteten Träger andocken. Auch die Disulfid-Brücken, die die schweren Antikörper-Ketten miteinander verbinden, kann man nutzen, wenn die Antikörper in Reih und Glied auf dem Slide angeordnet sein sollen. Dazu muss man die Disulfid-Bindungen lediglich reduzieren und auf der Trägeroberfläche SH-Gruppen anbringen. Schon formieren sich die Antikörper über Disulfid-Bindungen in nahezu perfekter Ordnung auf dem Slide.

Mit ähnlichen Tricks arbeiten Array-Hersteller, wenn sie Proteinen Ordnung auf den Objekträgern beibringen wollen. Sehr beliebt ist zum Beispiel die aus der Proteinreinigung altbekannte Kombination von Histidin-Tag und Nickel. Die aufzubringenden Proteine bekommen am C- oder N-terminalen Ende ein His-Tag verpasst und werden dann mit dem His-getaggten Ende voran auf einem Nickel-beschichteten Slide verankert. Da sich die Proteine auf diese Weise senkrecht zur Trägeroberfläche in die Höhe recken, sind sie für die Probensubstanzen nahezu optimal erreichbar. Hinzu kommt, dass sich diese Immobilisierungs-Methode perfekt mit der Reinigung His-getaggter Proteine über Ni-Säulen kombinieren lässt.

Noch in Kinderschuhen

Auf die so vorbereiteten Protein-Microarrays kann man im Grunde sämtliche Substanzen loslassen, von denen man annimmt, dass sie Proteine binden. Die Proben versieht man in der Regel mit einer Fluoreszenzmarkierung, die ein Signal aussendet, sobald die Substanz an ein immobilisiertes Protein auf dem Array andockt. Da auch diese Markierungen das Wechselspiel von Probe und immobilisiertem Protein stören können, arbeiten Array-Spezialisten verstärkt an Label-freien Detektionsmethoden. Zu diesen zählt zum Beispiel die Plasmon-Resonanz-Technologie, mit der man Massenänderungen misst, die während der Interaktion von mobilem und immobilisiertem Bindungspartner auftreten. Noch stecken die meisten Label-freien Detektions­methoden für Protein-Microarrays jedoch in den Kinderschuhen.


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 5/2009, Stand: April 2009, alle Angaben ohne Gewähr)


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Letzte Änderungen: 13.06.2009


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