Kratzen im Hals, verstopfte Nase, Gliederschmerzen. Das ist doch nicht etwa …? Zügig den Schnelltest hervorgeholt, Stäbchen in die Nase, ein paar Minuten warten und schon kann man das Ergebnis ablesen. Die Unmittelbarkeit der SARS-CoV-2-Schnelltests führt uns die Bedeutung der sogenannten Patienten-nahen Labordiagnostik (Point-of-Care Diagnostics, POC) deutlich vor Augen. POCs sind Diagnoseverfahren, die nicht in einem Zentrallabor durchgeführt werden, sondern direkt im Krankenhaus, in der Arztpraxis oder Apotheke – oder auch zu Hause beim Patienten. Weitere Beispiele für POCs sind Schwangerschafts- oder Blutzuckertests für Diabetiker, aber auch das Messen von Notfallparametern wie Blutgas- oder Blutgerinnungswerte auf Intensivstationen.
Zu den gängigsten Point-of-Care-Methoden zählen Lateral-Flow-Tests, die auf einer Kombination aus Dünnschicht-Chromatographie und Immundetektion beruhen. Da sich die Probe auf dem Streifen aber nur in eine Richtung, also unidirektional, bewegt, ist die Anwendungsbreite dieser Tests eingeschränkt. Die bidirektionale Wanderung in beide Richtungen ist bisher nur mit komplexen Mikrofluidik-Geräten möglich, die aus teuren und sperrigen Pumpen oder Durchfluss-Regelsystemen bestehen, deren Betrieb zudem eine Energiequelle erfordert.
Pflanzliche Proteine im Rotlicht
Das Team des Bioingenieurs Can Dincer vom Institut für Mikrosystemtechnik der Universität Freiburg will dieses Problem aus dem Weg räumen. In einem auf bioRxiv veröffentlichten Preprint stellt es einen Licht-gesteuerten OptoAssay vor, bei dem sich die detektierten Biomoleküle bidirektional bewegen können und keine zusätzlichen Wasch-Schritte oder externe Vorrichtungen zur Flusskontrolle nötig sind.
Der OptoAssay basiert auf der Licht-abhängigen Interaktion zweier pflanzlicher Proteine. Bei rotem Licht von etwa 650 Nanometern bindet der Phytochrome Interacting Factor 6 (PIF6) an den Pflanzenrezeptor Phytochrom B (PhyB). Setzt man das System hingegen fernem Rotlicht mit circa 713 Nanometern aus, ändert sich die Konformation des PhyB-Rezeptors und PIF6 wird wieder freigesetzt.
Dieses optogenetische System, das sich sozusagen per Lichtschalter kontrollieren lässt, verwenden viele Optogenetiker für die Kontrolle von Zellsignalwegen oder der Genexpression. Um es an den OptoAssay anzupassen, enthält die Testmembran des Assays eine quadratische Empfänger-Zone, die von einer ebenfalls quadratischen Sender-Zone umgeben ist. Eine Kerbe trennt die beiden Zonen. Nach der Zugabe der Probenlösung wird die Kerbe überbrückt und die beiden Zonen werden miteinander verbunden.
Konkurrenz mit Antagonist
Im Sender-Quadrat ist der Photorezeptor PhyB über eine Biotin-Neutravidin-Interaktion an die Nitrozellulose-Membran immobilisiert, im Empfänger-Quadrat befinden sich immobilisierte Antikörper, die an das zu detektierende Protein binden. Der OptoAssay basiert auf der Kompetition, wie Dincers Team anhand der Detektion Histidin-getaggter Proteine verdeutlicht. Die Histidin-getaggten Proteine in der Probe konkurrieren mit einem Antagonisten um die Bindung an die Antikörper im Empfänger-Quadrat. Bei den Antagonisten handelt es sich um PIF6-GFP-Proteine, die ebenfalls ein Histidin-Tag tragen. Sie können hierdurch an die Antikörper im Empfänger-Quadrat binden – je nach Lichtverhältnissen können sie aber auch an PhyB im Sender-Quadrat andocken.
Im ersten Schritt des OptoAssays wird das System mit rotem Licht beleuchtet. In diesem Zustand sind die Histidin-getaggten PIF6-GFP-Proteine an PhyB im Sender-Quadrat gebunden. Danach wird das System mit fernem Rotlicht bestrahlt und gleichzeitig die zu messende Probe hinzugegeben, wodurch Sender- und Empfänger-Quadrate miteinander verbunden werden. Das ferne Rotlicht setzt PIF6-Proteine frei, die mit den Histidin-getaggten Proteinen in der Probe um die Bindung an die Antikörper im Empfänger-Quadrat konkurrieren.
Smartphone-gesteuerte Photo-Box
Anschließend wird erneut rotes Licht eingesetzt, um ungebundene PIF6-GFP-Antagonisten wieder an PhyB zu binden und aus dem Empfänger-Quadrat zu entfernen. Dies erspart die sonst üblichen Wasch-Schritte und ermöglicht eine quantitative Auslesung des GFP-Signals im Empfänger-Quadrat. Aufgrund des kompetitiven Formats des OptoAssays ist die gemessene GFP-Fluoreszenz umgekehrt proportional zur Konzentration des zu bestimmenden Proteins.
Für die Proof-of-Principle-Experimente verwendeten die Freiburger eine Probe, die eine bekannte Konzentration Histidin-getaggter Proteine enthielt. Mit dieser konnten sie die erfolgreiche Kompetition belegen: Das GFP-Signal im Empfänger-Quadrat war in Gegenwart des Analyten niedriger, da durch die Kompetition weniger PIF6-GFP-Proteine an die immobilisierten Antikörper binden konnten. Da die Gruppe aber keine weiteren Messungen mit unterschiedlichen Analyt-Konzentrationen durchführte, bleibt noch abzuwarten, wie sensitiv und robust die Methode ist.
Wie sieht das Gerät zur Durchführung des OptoAssays konkret aus? Dincers Mannschaft konstruierte mittels 3D-Druck eine Photo-Box für die Illumination des OptoAssays mit rotem Licht sowie fernem Rotlicht. Die Beleuchtung lässt sich mit einem Smartphone steuern, das über ein Bluetooth-Modul mit der Elektronik der Photo-Box verbunden ist. Die Gruppe hat auch schon eine Idee, wie es mit dem OptoAssay weiter gehen könnte: Mit einer entsprechenden Smartphone-App könnte man die Beleuchtung der Proben und die Auswertung des Assays auch automatisieren, um den OptoAssay noch benutzerfreundlicher zu gestalten.
Mihaela Bozukova
Urban N. et al. (2022): OptoAssay – Light-controlled dynamic bioassay using optogenetic switches. bioRxiv, DOI: 10.1101/2021.11.06.467572
Bild: Pixabay/Deniz_Turgut