Tipp 89:
Was passiert bei unspezifischer PCR?
Antwort 2

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"In unserem Labor hält sich hartnäckig das Gerücht, dass in einer PCR, die kein spezifisches Produkt liefert, anstatt der Template-DNA die Primer vermehrt würden. Ist das blanker Unsinn oder tatsächlich möglich?"

Antwort 2: "Eine Vermehrung der Primer während der PCR ist meiner Meinung nach nur unter besonderen Umständen möglich. Eine Amplifikation von DNA setzt voraus, dass einzelsträngige, relativ kurze DNA-Fragmente (eben die Primer) an die zu amplifizierende DNA binden und somit den Startpunkt für die jeweilige Polymerase erst ermöglichen. Im Idealfall sollte es keine Fragmente einzelsträngiger DNA geben, die an die Primer binden und einen Startpunkt auf ihnen festlegen. Gut, es gibt die dNTPs, doch damit diese binden, müsste man mit der Annealingtemperatur (AT) schon stark in Richtung Keller gehen. Eine weitere Möglichkeit, die durch die Verwendung von Primer-Design-Programmen aber nahezu ausgeschlossen werden kann, ist eine Bindung der Primerpaare aneinander.
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Die Ursache für einen Schmier auf dem Gel ist meiner Meinung nach eher auf die unspezifische Bindung der Primer an mehreren Stellen der zu amplifizierenden DNA zurückzuführen. Eine weitere Ursache ist oft eine zu niedrige AT. Bewährt hat sich hier die "Touchdown-PCR", in der man mit einer erhöhten AT beginnt und sie dann in den ersten 5-10 Zyklen um jeweils 1 °C pro Zyklus senkt. Damit gibt man der spezifischen Bindung einen "Vorsprung", da bei ihr die AT am höchsten ist.

Grüße von

Fabian Axthelm, Universität Basel"





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Letzte Änderungen: 11.01.2006


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