Tipp 88:
Was passiert bei unspezifischer PCR?
Antwort 1

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"In unserem Labor hält sich hartnäckig das Gerücht, dass in einer PCR, die kein spezifisches Produkt liefert, anstatt der Template-DNA die Primer vermehrt würden. Ist das blanker Unsinn oder tatsächlich möglich?"

Antwort 1: "Das ist tatsächlich nicht nur die übliche "wir erzählen dem neuen Doktoranden mal einen vom Pferd"-Geschichte. In unserem Labor haben wir einige Zeit mit dem Design kurzer (16nt) DNA-Fragmente für das DNA-Computing gearbeitet. Bei der Amplifikation solcher Gemische kam es immer wieder zur Bildung definierter Primer-Dimere. Ein paar der Problemkinder haben wir sequenziert und uns gewundert, wie wenig Übereinstimmung für eine Elongation ausreicht.

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Auch wenn ich glaube, dass in der Regel einzelne Nukleotide nicht ausreichen, um zwei Primer hybridisieren zu lassen, gibt es immer noch die gemeine Angewohnheit von Polymerasen, Primer Template-unabhängig' zu verlängern. Diese Reaktion macht man sich z.B. bei einigen Klonierungskits zu Nutze (etwa Invitrogens Topo-TA Cloning Kit) [s. Brownstein, M.J., Carpten, J.D., Smith, J.R. (1996) Modulation of non-template nucleotide addition by Taq DNA polymerase: primer modifications that facilitate genotyping. Biotechniques 20:1004-1006].

Mein Tipp: Schaffen Sie während des Annealing-Schritts der PCR möglichst stringente Hybridisierungbedingungen und lassen Sie einfach mal eine Kontroll-PCR ohne Template laufen. Taucht dann eine Bande auf, hat der Experimentator entweder geschlampt oder die Primer treiben es tatsächlich bunt im Tube.

Viele Grüße, Thomas Rücker, Fraunhofer-Gesellschaft,
Abt. Biomolekulare Optische Systeme, St. Augustin"

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Letzte Änderungen: 11.01.2006


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