Tipp 88:
Was passiert bei unspezifischer PCR?
Antwort 1

"In unserem Labor hält sich hartnäckig das Gerücht, dass in einer PCR, die kein spezifisches Produkt liefert, anstatt der Template-DNA die Primer vermehrt würden. Ist das blanker Unsinn oder tatsächlich möglich?"

Antwort 1: "Das ist tatsächlich nicht nur die übliche "wir erzählen dem neuen Doktoranden mal einen vom Pferd"-Geschichte. In unserem Labor haben wir einige Zeit mit dem Design kurzer (16nt) DNA-Fragmente für das DNA-Computing gearbeitet. Bei der Amplifikation solcher Gemische kam es immer wieder zur Bildung definierter Primer-Dimere. Ein paar der Problemkinder haben wir sequenziert und uns gewundert, wie wenig Übereinstimmung für eine Elongation ausreicht.


Auch wenn ich glaube, dass in der Regel einzelne Nukleotide nicht ausreichen, um zwei Primer hybridisieren zu lassen, gibt es immer noch die gemeine Angewohnheit von Polymerasen, Primer Template-unabhängig' zu verlängern. Diese Reaktion macht man sich z.B. bei einigen Klonierungskits zu Nutze (etwa Invitrogens Topo-TA Cloning Kit) [s. Brownstein, M.J., Carpten, J.D., Smith, J.R. (1996) Modulation of non-template nucleotide addition by Taq DNA polymerase: primer modifications that facilitate genotyping. Biotechniques 20:1004-1006].

Mein Tipp: Schaffen Sie während des Annealing-Schritts der PCR möglichst stringente Hybridisierungbedingungen und lassen Sie einfach mal eine Kontroll-PCR ohne Template laufen. Taucht dann eine Bande auf, hat der Experimentator entweder geschlampt oder die Primer treiben es tatsächlich bunt im Tube.

Viele Grüße, Thomas Rücker, Fraunhofer-Gesellschaft,
Abt. Biomolekulare Optische Systeme, St. Augustin"




Letzte Änderungen: 11.01.2006