Tipp 81:
ECL-Blots hausgemacht

Konkurrenzlos preisgünstiges ECL-Detektionsreagenz

Das nachfolgende Rezept hat Stefan Jean-Pierre Haas (Institut für Anatomie, Uni Rostock) von einer Arbeitsgruppe der TU Kaiserslautern übernommen und mit zwei engagierten Studenten verifiziert. Wegen der seiner Meinung nach hervorragenden Funktionsweise gibt er es den Laborjournal-Lesern gerne weiter:

Bei einem Proteomics-Methodenkurs in der Abteilung für Tierphysiologie an der TU Kaiserslautern fiel mir folgendes Protokoll für ein konkurrenzlos preisgünstiges selbst angefertigtes Western Blot ECL-Detektionsreagenz in die Hände. Auch wenn einige erfahrene Molekularbiologen nur müde lächeln werden und dieses Rezept für einen alten Hut halten, möchte ich diesen Tip den übrigen Laborjournal-Lesern nicht vorenthalten. Zusammen mit den Medizinstudenten Grit Lessner und Andreas Hilla habe ich dieses Rezept während des Methodenkurses getestet und mit käuflichen ECL-Detektionskits verglichen (siehe Abbildung rechts). Nach einmal Hinschauen und ausführlichen Preisvergleichen habe ich sofort auf "Cheap ECL-Homemade" umgestellt!


Das Rezept:

• Solution A (SA; in Kühlschrank lagern): 200 ml 0,1M TRIS-HCl (pH 8,6) 50 mg Luminol (z.B. Sigma A4685)
• Solution B (SB; bei RT dunkel lagern) 11 mg para-Hydroxycoumarinsäure (z.B. Sigma C9008) in 10 ml DMSO lösen
• H₂O₂ (35 %)

Die Durchführung:

• 1 ml SA + 0,3 µl H2O2 (30 %) + 100 µl SB mischen
• Blot-Membran 2 min inkubieren (Lösung dabei gut verteilen)
• Filmexposition Für eine 13 x 7 cm grosse Membran genügen 4 ml Lösung (4 ml SA + 1,2µl H2O2 (30 %) + 400 µl SB mischen).

Das Ergebnis:


In den mit M bezeichneten Lanes wurde ein Gewichtsstandard aufgetragen. Die Lanes 1 bis 3 enthalten Proteinlysate von immortalisierten neuralen Progenitorzellen der Linie CSM14.1 (Lane 1: 20 µg Gesamtprotein, Lane 2: 14 µg Gesamtprotein, Lane 3: 7 µg Gesamtprotein). Detektiert wurde b-Aktin (bei ca. 42 kDa). Die Membran wurde erst kurz vor der ECL-Inkubation in drei Teile zerschnitten, alle zuvor erfolgten Schritte fanden daher unter identischen Bedingungen statt.


Fazit

In A sind die für Beta-Aktin sepzifischen Banden sehr gut erkennbar, in B hingegen war nach einer Minute Exposition der Röntgenfilm blank und bei C kamen zu den überstrahlten Banden für b-Aktin noch weitere unspezifische Banden (von ca. 24-116 kDa) hinzu.




Letzte Änderungen: 10.06.2005