Info

Tipp 81:
ECL-Blots hausgemacht


ANZEIGE

Info

Der neue Pipettierroboter Liquid Handling Station flow schützt Ihre wertvollen Proben vor Partikeln und Mikroorganismen. mehr


Konkurrenzlos preisgünstiges ECL-Detektionsreagenz

>Das nachfolgende Rezept hat Stefan Jean-Pierre Haas (Institut für Anatomie, Uni Rostock) von einer Arbeitsgruppe der TU Kaiserslautern übernommen und mit zwei engagierten Studenten verifiziert. Wegen der seiner Meinung nach hervorragenden Funktionsweise gibt er es den Laborjournal-Lesern gerne weiter:

Bei einem Proteomics-Methodenkurs in der Abteilung für Tierphysiologie an der TU Kaiserslautern fiel mir folgendes Protokoll für ein konkurrenzlos preisgünstiges selbst angefertigtes Western Blot ECL-Detektionsreagenz in die Hände. Auch wenn einige erfahrene Molekularbiologen nur müde lächeln werden und dieses Rezept für einen alten Hut halten, möchte ich diesen Tip den übrigen Laborjournal-Lesern nicht vorenthalten. Zusammen mit den Medizinstudenten Grit Lessner und Andreas Hilla habe ich dieses Rezept während des Methodenkurses getestet und mit käuflichen ECL-Detektionskits verglichen (siehe Abbildung rechts). Nach einmal Hinschauen und ausführlichen Preisvergleichen habe ich sofort auf "Cheap ECL-Homemade" umgestellt!

ANZEIGE

Info

Alle 11 Minuten verliebt sich eine Stammzelle in StemFit®... mehr


Das Rezept:
  • Solution A (SA; in Kühlschrank lagern): 200 ml 0,1M TRIS-HCl (pH 8,6) 50 mg Luminol (z.B. Sigma A4685)
  • Solution B (SB; bei RT dunkel lagern) 11 mg para-Hydroxycoumarinsäure (z.B. Sigma C9008) in 10 ml DMSO lösen
  • H2O2 (35 %)
Die Durchführung:
  • 1 ml SA + 0,3 µl H2O2 (30 %) + 100 µl SB mischen
  • Blot-Membran 2 min inkubieren (Lösung dabei gut verteilen)
  • Filmexposition Für eine 13 x 7 cm grosse Membran genügen 4 ml Lösung (4 ml SA + 1,2µl H2O2 (30 %) + 400 µl SB mischen).
Das Ergebnis:



In den mit M bezeichneten Lanes wurde ein Gewichtsstandard aufgetragen. Die Lanes 1 bis 3 enthalten Proteinlysate von immortalisierten neuralen Progenitorzellen der Linie CSM14.1 (Lane 1: 20 µg Gesamtprotein, Lane 2: 14 µg Gesamtprotein, Lane 3: 7 µg Gesamtprotein). Detektiert wurde b-Aktin (bei ca. 42 kDa). Die Membran wurde erst kurz vor der ECL-Inkubation in drei Teile zerschnitten, alle zuvor erfolgten Schritte fanden daher unter identischen Bedingungen statt.


Fazit

In A sind die für Beta-Aktin sepzifischen Banden sehr gut erkennbar, in B hingegen war nach einer Minute Exposition der Röntgenfilm blank und bei C kamen zu den überstrahlten Banden für b-Aktin noch weitere unspezifische Banden (von ca. 24-116 kDa) hinzu.

ANZEIGE

Info

Kapazität für 24 Gefäße und eine Geschwindigkeit von bis zu 21.330 × g mehr

ANZEIGE

Info

Whether you are considering using Droplet Digital PCR in the future, or already using it every day, this meeting is the perfect opportunity to ... mehr

ANZEIGE

Info

Ab dem 11.5. zeigen 3.800 Aussteller aus aller Welt Innovationen für Chemie, Pharma- & Lebensmittelindustrie ... mehr




Letzte Änderungen: 10.06.2005


Diese Website benutzt Cookies. Wenn SIe unsere Website benutzen, stimmen SIe damit unserer Nutzung von Cookies zu. Zur ausführlichen Datenschutzinformation