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Tipp 37:
Leserbrief zum "Unblot"
Und er funktioniert doch!

...meint Carolin Kutzki/Fa. Perbio zum Thema "Unblot". Im letzten Laborjournal 7-8/02 hatte sich unser Leser Ralph Schill/Universität Tübingen auf Seite 60 kritisch zu Sinn und Zweck dieser abgekürzten Westernblot-Methode geäußert. Die aber funktioniere recht gut, so Kutzki – sofern man folgende Punkte beachtet:


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"Das "Unblot-System", das von Surbi Desai und Kollegen in unseren Laboren entwickelt wurde, ist primär auf Zeitersparnis ausgerichtet. Die Sensitivität liegt bei optimalen Bedingungen im Bereich von 1 ng pro Bande, ist also deutlich weniger sensitiv als beim Westernblot. Was sind nun aber optimale Bedingungen?

Entscheidend ist zum einen die Qualität des Gels: Im Originalartikel von Desai et al. 2001 wurden vorgegossene Gele verschiedener Hersteller getestet. Es hat sich gezeigt, das diese sehr unterschiedliche Ergebnisse bezüglich der Sensitivität aufweisen. Auch selbstgegossene Gele wurden getestet: Die Sensitivität des Systems für selbstgegossene Gele liegt um den Faktor 20-25 niedriger als mit den meisten Fertiggelen. Es ist wichtig, dass kein SDS im Gel vorhanden ist – bei den meisten Fertiggelen ist dies der Fall. Weiterhin scheint ein Teil der Proteine an unsilanisierten Glassplatten haften zu bleiben, wodurch die Sensitivität drastisch reduziert wird.

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Ebenso wichtig sind Antiköper und Substrat. Da die Antikörper auf Grund ihrer Größe das Gel nicht vollständig durchdringen, wird nicht das gesamte Protein einer Bande detektiert. Um dies zu kompensieren, muss die Menge an Antikörpern höher sein als beim Westernblot. Zusätzlich setzen wir ein sehr sensitives Chemilumineszenzsubstrat zur Detektion ein, welches im Western bloß noch Femtogramm-Mengen detektieren kann.

Fazit:
Einfach und schnell ist die In-Gel-Detektion definitiv, allerdings nicht so sensitiv wie ein Westernblot. Das Unblot ist eine gute Alternative, wenn ausreichend Protein zur Verfügung steht und der Anwender schnell an ein Erlebnis kommen will – ohne den zeitaufwendigen Blottingschritt und ohne mögliche Blotting-Artefakte."
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Letzte Änderungen: 08.09.2004


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