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Tipp 33:
Proteine (ent-)färben
Die Faulheit besiegt

...hat eine Laborjournal-Leserin aus Göttingen. Schon ab und zu dachte sie daran, ihre privaten Laborgeheimnisse“ weiterzugeben, war dazu aber immer zu faul“. Nun hat sich die treue Laborjournal-Leserin aufgerafft und liefert zunächst einige Anmerkungen zu Tipp 24:


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Zum Trick mit der unkonventionellen Gelentfärbung möchte ich einige Anmerkungen aus meiner Laborpraxis machen, um anderen Laborschaffenden einigen Frust zu ersparen: Ich verwende seit neun Jahren eine Färbung, die ausdrücklich zum anschließenden Blotten beschrieben wurde (BioTechniques 12 (5), 1992). Die Autoren Thompson & Larson beschreiben darin die Möglichkeit des Blottens auf Membranen, nachdem die Gele in 0,25 % Coomassie R250 gefärbt, in 10 % Essigsäure entfärbt und zur Blotvorbereitung in 50 mM Tris pH 7,5 /1% SDS äquilibriert wurden. Danach wird das Gel im eigentlichen Blotpuffer äqulibriert, und der Blot wie üblich durchgeführt.

Die Blaufärbung der Proteine verschwindet bei einigen (schwächeren) Banden im Laufe der Waschschritte beim Immunblot, daher ist es sinnvoll, vorher einige Bleistiftmarkierungen anzubringen. Auch für die Edman-Sequenzierung können die vorgefärbt geblotteten Proteine problemlos (ohne weitere Vorbehandlung) eingesetzt werden. Besonders beim Blotten auf kationisch derivatisierten Membranen ergeben sich Vorteile, da sich durch die "Vorfärbung" teure Spezialfärbungen nach dem Blot erübrigen. Die Gelbanden können auch direkt nach der Färbung ausgeschnitten und einem In-Gel-Verdau mit z.B. Trypsin unterzogen und anschließend mit MS-Methoden untersucht werden. Sollte die Färbung nicht sensitiv genug gewesen sein, kann mit dem bereits Coomassie-gefärbten Gel eine Silberfärbung durchgeführt werden.

Die geschilderte Methode verwende ich nahezu ausschließlich, da ich damit bei jedem Gel auch nach der Färbung noch entscheiden kann, ob ein Blot sinnvoll durchzuführen ist oder nicht. Das spart Probenmaterial, das für andere Versuche eingesetzt werden kann.

Ein Tipp: Sollten die Proteinbanden nach dem Blot auf der Membran nur noch schwach zu erkennen sein, so liegt dies am basischen Wert des Blotpuffers. Legt man die Blotmembran für 30 Sekunden in 0,5-1 % Essigsäure, erstrahlen die Banden wieder in herrlichem Blau. Tun sie das nicht, so sind sie oft noch auf dem Ursprungs-Gel intensiv zu erkennen. Oder man durchsucht als letztes den Blotpapierstapel nach blauen Spuren (in diesem Fall waren die Blotbedingungen zu rigide). Zur Beschleunigung der Gel-Entfärbung gibt man ein Zellstofftuch (Kleenex“) in die Schale, dann ist nach 2-3 Stunden die Identifikation von Banden möglich.

Ich möchte aber davor warnen, die eingangs erwähnte Methode der "Gelentfärbung per Elektroblot" generell anzuwenden. Um das angegebene Prozedere genau verifizieren zu können, müsste man die Parameter von Blot sowie (Ent-)Färbung genau kennen, um allgemeingültige Regeln für andere Anwender aufzustellen.“


Letzte Änderungen: 08.09.2004


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