Tipp 26:
Northern-/Southernblots
Optimal gefärbte Banden

... sorgen nicht nur bei Wolfgang Mages vom Regensburger Lehrstuhl für Genetik für zufriedene Gesichter Aber wie kriegt man die? Der akademische Rat Mages weiss es:

Eine ständig wiederkehrende Frage bei Southern- und Northern-Hybridisierungen ist folgende: Wann soll man mit den Stringenz-Waschungen aufhören und stattdessen den Röntgenfilm auflegen? Einerseits möchte man keine schwachen Banden (und damit Information) durch zu stringentes Waschen verlieren, andererseits möchte man auch keinen unspezifischen Hintergrund und zu viele ebensolcher Banden auf dem fertigen Werk sehen.

Die Lösung: Nachdem zuerst bei geringer Stringenz (z.B. 2 x SSC bei RT) lose gebundene Sondenmoleküle entfernt wurden (der Punkt ist erreicht, wenn durch weiteres Waschen praktisch keine Radioaktivität mehr in den Waschpuffer gelangt), wird die Membran mit der Nukleinsäure-Seite nach oben kurz auf Saugpapier (z.B. Whatman 3 MM) gelegt und die FIüssigkeit abgesaugt, indem man mit einer stumpfen Pinzette an verschiedenen Stellen sanft auf die Membran drückt, bis keine "Pfützen“ mehr zu sehen sind.

Die Membran wird anschließend sofort auf eine nicht saugfähige Unterlage gelegt (z.B. eine dünne Glasplatte oder eine unbeschichtete(!) Xerox-Folie) und in Haushaltsfolie eingeschlagen. Wichtig ist dabei nur eines: Die Membran darf nicht austrocknen. Dann werden verschieden lange Expositionen auf Röntgenfilm gemacht. Ist das Ergebnis bereits zufriedenstellend: fein! Ist es das noch nicht (z.B. weil noch zu viel Hintergrund vorhanden ist), kann die Membran nun jederzeit bei höherer Stringenz weiter gewaschen und dann erneut nach dem gleichen Verfahren exponiert werden. Insgesamt erhält man so meistens mehr Information und auch "schönere" Ergebnisse."


Letzte Änderungen: 08.09.2004