(13.09.2021) In Laborjournal 5/21 schilderten Tanja Karl und Gertie Janneke Oostingh von der FH Salzburg ihre positiven Elektrophorese-Erfahrungen mit dem sogenannten SuperBuffer. Was die beiden nicht wussten: Der SuperBuffer ist ein Plagiat. Der regelmäßige Laborjournal-Leser Axel Pagenstecher stellt die Sache in dem nachfolgenden Artikel richtig. In einem weiteren Leserbrief erklärt Christoph Heller die Grundlagen der DNA-Elektrophorese.
Stellen Sie sich vor, es ist (je nach Ihrer Veranlagung) Spätnachmittag, Abend oder Nacht. Der Restriktionsverdau oder die PCR ist gelaufen, jetzt nur noch ein analytischer Lauf im Agarosegel und dann geht’s nach Ansetzen einer Downstream-Über-Nacht-Applikation in den Feierabend. Dumm nur, dass zwischen Ihnen und der Freizeit noch der Gel-Lauf steht, der – je nach Größe der zu trennenden Fragmente – auch mal eine Stunde dauern kann. Doch Rettung naht! Ist es eine Zeitmaschine? Ist es eine Anomalie der Minkowski-Metrik? Nein, es ist der SuperBuffer (SB).
Falls Ihnen als treue Leser der Tipps und Tricks des Laborjournals der SuperBuffer bekannt vorkommt, liegen Sie richtig: Über den SuperBuffer haben Sie bereits in der Laborjournal-Ausgabe 5/2021 auf Seite 64 lesen können (Link). Die Salzburger Autoren beschrieben dort einen Natrium-Borat-Puffer, der eine Reihe von Vorteilen hat – unter anderem ermöglicht er eine schnelle Auftrennung in zehn bis zwanzig Minuten bei guter Bandenschärfe. Zitiert wurde die Methode einer chinesischen Gruppe (Zhang et al.), die 2014 publiziert wurde (Gene 487: 72-74). Bei der Lektüre dieses Tipps-und-Tricks-Artikels ging es mir genau wie Ihnen beim Lesen obiger Einleitung: Das kenn ich doch!
In guter konfuzianischer Tradition (siehe Überschrift) hatten die chinesischen Autoren die bereits 2004 in Biotechniques erschienene Arbeit von Jonathan Brody und Scott Kern von der Johns Hopkins University School of Medicine nachgekocht (BioTechniques 36: 214-16) – mit einer etwas verfremdeten Darstellungsweise der Mengen für die Pufferherstellung und einer Punkt für Punkt nachvollzogenen Darstellung der Ergebnisse mit diesem Puffer.
Das Sahnehäubchen zum Schluss ist der aufgepeppte Name des Puffers – so wird aus einem boring Sodium-Boric-Acid (SB)-Puffer bei Brody und Kern der marvelous SuperBuffer (SB)-Puffer bei Zhang et al. In der Zusammenschau sind die Parallelen unübersehbar. Das Zhang-Paper ist also ein Beispiel schlechter wissenschaftlicher Tradition, beziehungsweise ein Plagiat ohne Angabe der originalen Publikation. Das ist unschön, verdienen Brody und Kern es doch, für ihre Arbeit geehrt, sprich zitiert zu werden.
Wir verwenden den Puffer der beiden seit 2004 für die meisten Agarose-Anwendungen. Wie oben betont und von Tanja Karl und Gertie Janneke Oostingh in LJ 5/21 dargestellt, können mit diesem System vor allem kleinere Fragmente bis zu 1.000 bp extrem schnell mit guter Auflösung aufgetrennt werden, weil die Erwärmung des SB-Gels deutlich geringer ist als in Tris-basierten Gelen (Brody und Kern haben das gemessen). Karl und Oostingh heben in ihrem Artikel nicht auf den Zusammenhang von Laufgeschwindigkeit und Temperatur ab, da sie TAE- und SB-Gele bei gleicher Spannung laufen ließen und beide Gele am Ende unter 30 °C aufwiesen.
SB-Gele können allerdings bei deutlich höheren Spannungen, zum Beispiel 20 bis 25 V/cm, gefahren werden – und laufen dadurch deutlich schneller als Tris-basierte Gele, die bei derart hohen Spannungen im Zweifel schmelzen (Brody und Kern). Zudem kann der Puffer mehrfach verwendet werden, ohne merkliche Verschlechterung der Gel-Läufe. Brody und Kern zeigen in ihrer Publikation (Abb. 2), dass der Strom in SB-Gelen erst nach über drei Stunden merklich abnimmt, was auf eine Erschöpfung der Elektrolyte schließen lässt. In dieser Zeit kann man locker fünf und mehr Läufe á 20 Minuten unterbringen und hat noch Reserve.
Bei Fragmenten mit deutlich über 1 kbp, wie etwa linearisierten Plasmiden, fällt im SB-Puffersystem auf, dass Auflösung, Bandenschärfe und merkwürdigerweise auch die Übereinstimmung mit DNA-Leitern schlechter sind als in TAE-Gelen. Für solche Auftrennungen verwenden wir bei speziellen Fragestellungen auch TAE-Gele.
Brody und Kern geben in ihrem Artikel eine Erklärungsmöglichkeit, wie TAE/TBE mit Tris als Kation schnelle Gel-Läufe verhindern: Während des Gel-Laufes mit Tris und EDTA kommt es zu einem raschen Anstieg des Stroms im Puffer, der wiederum eine Erhöhung der Temperatur im Gel bedingt (die zugeführte Leistung P ist das Produkt aus Spannung und Strom). Die Temperaturerhöhung ist unerwünscht, da sie zur Diffusion der Banden, Denaturierung und im Extremfall zum Schmelzen des Gels führen kann. Sie muss also durch Begrenzung der Spannung auf 5 bis 10 V/cm verhindert werden. Natrium als Kation mit Borat als Anion zeigt diesen Effekt in deutlich geringerem Umfang (Brody und Kern, Abb. 2), sodass mit dem SB-Puffer weit höhere Spannungen bei geringerem Temperaturanstieg und damit höhere Laufgeschwindigkeiten möglich sind.
Last but not least und für die Pfennigfuchser unter Ihnen relevant: Der SB-Puffer ermöglicht nicht nur eine Zeitersparnis – er ist auch deutlich billiger als TAE oder erst recht TBE. Die Kosten sinken weiter, wenn man den SB-Puffer mehrfach benutzt.
Und für die homozygoten Schotten oder Schwaben gibt es einen Trick, den ich vor zwanzig Jahren von einem indischen Postdoc gelernt habe: Auch die (analytischen!) Gele können mehrfach benutzt werden: Einfach nach Gebrauch zurück in den Erlenmeyer-Kolben, in der Mikrowelle wieder verflüssigen und danach neu gießen. Im Gel enthaltene DNA ist dann homogen verteilt und praktisch nicht mehr sichtbar. Der genaue Prozentsatz der Agarose ist hier durch Verdampfung etwas verändert, das macht nach unserer Erfahrung aber für Restriktionsanalysen oder Ähnliches nichts aus. Wiederverwendete Gele dürfen jedoch auf keinen Fall für präparative Anwendungen verwendet werden – Sie bekommen es sonst mit unkontrollierbaren Kontaminationen in Ihrem Bandenausschnitt zu tun.
Axel Pagenstecher
Direktor der Abteilung Neuropathologie am
Universitätsklinikum Marburg