(12.10.2020) Die Extraktion von Pflanzen-DNA soll möglichst schnell, einfach und kostengünstig sein. Mit der richtigen Extraktionsmethode und einigen simplen Tricks gelingt dieser Spagat.
Einige nützliche und allgemeingültige Tipps für die erfolgreiche DNA-Extraktion aus Pflanzen hat der japanische Forscher Ichiro Kasajima von der Iwate Universität parat (Trends in Res. DOI: 10.15761/TR.1000115). An erster Stelle steht die Auswahl der richtigen Extraktionsmethode, die zur Pflanzenart passen sollte. Für Modellpflanzen wie Arabidopsis und Tabak reichen normalerweise einfache Methoden aus, etwa die Extraktion mit SDS-Puffer und Fällung mit Isopropanol. Trotz geringer Reinheit und Ausbeute ist die extrahierte DNA in der Regel sauber genug für eine stabile PCR-Amplifikation.
Weniger anfällig für Verunreinigungen ist die Extraktion mit CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid)-Puffer, die anschließend mit einer Chloroform-Extraktion und der Ethanolfällung kombiniert wird. Diese Technik ist aber etwas aufwendiger, da die Chloroform-Extraktion mehrmals wiederholt werden muss. Kasajima empfiehlt, den Extraktionspuffer für die etwas störrischeren Gartenpflanzen zu modifizieren, und einen alkalischen Puffer mit Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP), CTAB und 10 mM NaCl zu verwenden.
Unabhängig vom gewählten Extraktionsprotokoll oder Puffer empfielt Kasajima, die DNA aus voll entwickelten Blättern zu extrahieren. Das Volumen des Extraktionspuffers sollte etwa fünfmal höher sein als das Gewicht der Pflanzenprobe (fünf Milliliter Puffer pro einem Gramm Blatt), bei schwierig aufzubereitendem Pflanzenmaterial sogar zehnmal höher. Da der Vermahlungsgrad des Pflanzenmaterials der wichtigste Erfolgsgarant bei der DNA-Extraktion ist, sollte man bei der Zerkleinerung der Blätter mit Mörser und Pistill in flüssigem Stickstoff ein maximales Blattgewicht von einem Gramm nicht überschreiten. Möchte man Pflanzen-DNA in großem Maßstab aus vielen Pflanzen extrahieren, sind schnellere Verfahren geschickter als aufwendigere, die mehrere Extraktionsschritte benötigen.
Eine der beliebtesten Methoden, um pflanzliche DNA für die PCR-Amplifikation zu gewinnen, ist das DNA-Extraktionsverfahren nach Edwards, bei dem zunächst die Membran in SDS gelöst und anschließend die DNA mit Isopropanol gefällt wird (Nucleic Acids Res. 19 (6): 1349).
Im Prinzip geht es kaum schneller, wenn man keine Qualitätseinbußen der Probe in Kauf nehmen möchte. Die Molekularbiologen Wei Hu und Clark Lagarias von der University of California Davis präsentieren jedoch in einem bioRxiv-Preprint einen simplen Trick, mit dem man die Methode noch weiter vereinfachen kann (www.biorxiv.org/content/10. 1101/2020.02.13.948455v1).
Anstatt die Fällung erst im zweiten Schritt in einem neuen Gefäß vorzunehmen, geben Hu und Lagarias Isopropanol direkt im ersten Schritt zum Homogenat und führen die Extraktion im selben Zentrifugenröhrchen durch. Nach Zentrifugation und Verwerfen des Überstands reicht es, das Pellet ganz kurz an der Luft zu trocknen und danach in Wasser zu resuspendieren. Mit einer weiteren Zentrifugation im selben Röhrchen fällt man die unlöslichen Zellbestandteile und kann anschließend die DNA-Probe für die PCR-Analyse nach gerade mal zehn Minuten aus dem Überstand entnehmen. Das zweite Gefäß für die Isopropanol-Präzipitation der DNA ist überflüssig.
Ein neues magnetisches Extraktionsverfahren mit rekordverdächtig schneller Extraktionszeit entwickelten die Molekularbiologin Patrizia Rubiolo und ihr Team von der Universität Turin (Plant Methods 15: 23). Die Gruppe optimierte eine Technik, bei der DNA mit magnetischen Ionenflüssigkeiten (MILs) aus Pflanzen extrahiert wird. Ionische Flüssigkeiten sind geschmolzene Salze organischer oder anorganischer Kationen und Anionen, die je nach Art der Ionen ganz spezifische chemische sowie physikalische Eigenschaften besitzen. Mithilfe der Ionenzusammensetzung können sie gezielt für bestimmte Anwendungen angepasst werden.
Insbesondere hydrophobe MILs mit Kobalt oder Nickel eignen sich nach den Ergebnissen der Turiner Forscher sehr gut, um pflanzliche DNA zu extrahieren. Hierzu gibt man wenige Mikroliter der hydrophoben MIL direkt nach der Zelllyse in die wässrige Probenlösung. Nach dreißig Sekunden wird die mit DNA angereicherte MIL mit einem Stabmagneten eingesammelt und anschließend mithilfe eines externen magnetischen Feldes wieder zurückgewonnen.
Die extrahierte DNA ist mit PCR- und fluoreszenzbasierten Quantifizierungsmethoden kompatibel und kann direkt für nachfolgende Analysen verwendet werden. Im Vergleich zu anderen Extraktionsmethoden ist die DNA-Ausbeute von etwa drei Nanogramm pro Mikroliter aber eher klein. Für PCR-Analysen reicht die Menge jedoch aus. Die MIL-Methode punktet vor allem mit der unschlagbar kurzen Extraktionszeit von zwei Minuten. Darüber hinaus kommt sie ohne Zentrifugationsschritte aus und benötigt nur kleine Chemikalienmengen. Aufgrund der Magnettechnik lässt sie sich zudem hervorragend automatisieren.
Miriam Colindres