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Tipp 210: Flexible siRNA-Zustellung

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Eine clevere Versende-Plattform für siRNAs könnte neuen Schwung in die RNAi-Therapie bringen.

Zu Beginn des neuen Milleniums war die Hoffnung groß, dass man die wenige Jahre zuvor entdeckte RNA-Interferenz (RNAi) für die Bekämpfung von Krankheiten einsetzen könnte. Doch nach der ersten Euphorie setzte bei der Suche nach neuen, auf RNAi basierenden Wirkstoffen schon bald der große Katzenjammer ein. Der Schweizer Pharma-Gigant Roche gab die RNAi-Wirkstoffforschung 2010 praktisch über Nacht auf, und auch viele kleine Biotech-Firmen stiegen frustriert aus der RNAi-Forschung aus.


Die Forschungsabteilungen der Firmen hatten nicht damit gerechnet, dass es so schwer sein würde, die für das Gene Silencing nötigen siRNA-Duplexe in die Zielzellen zu schleusen – und zwar möglichst ohne Nebenwirkungen. Nackte, negativ geladene siRNA-Moleküle können die Zellmembran nicht überwinden. Meist werden sie deshalb mit Liganden modifiziert oder in Lipid-Nanopartikel (LNP) eingebaut, um sie in die Zelle zu schmuggeln. Sowohl Liganden als auch Lipid-Nanopartikel können jedoch Probleme bereiten und toxisch für die Zelle sein. Ein häufig eingesetztes siRNA-Anhängsel ist N-Acetylgalactosamin (GalNAc), das an einen Hepatozyten-Rezeptor bindet und so die Aufnahme in die Leberzellen durch rezeptorvermittelte Endocytose einleitet. Der Trick mit ­GalNAc funktioniert aber nur in Leberzellen. Und auch die gängigen Techniken für die Zustellung von siRNAs über Lipid-basierte Nanopartikel beschränken sich fast ausschließlich auf Leberzellen.

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Neuer Ansporn

Bei diesen Schwierigkeiten und Einschränkungen ist es kein Wunder, dass sich viele Firmen aus der RNAi-Wirkstoffforschung verabschiedeten. Neue Motivation, wieder einzusteigen, könnten sie aus einer interessanten Methode gewinnen, mit der sich siRNAs in beliebige Zellen dirigieren lassen (Nature Nanotechnology 13: 214-19). Entwickelt hat die Technik eine Gruppe um Dan Peer vom Laboratory of NanoMedicine der Tel Aviv University in Israel, zu der auch Judy Liebermann von der Harvard Medical School und Mark Behlke von der US-Firma Integrated DNA Technologies gehörten.

Dreh- und Angelpunkt der neuen siRNA­Strategie ist ein Protein, das Peers Team Anchored Secondary scFv Enabling Targeting oder kurz ASSET nennt. Entscheidend für die Zustellung der siRNAs an die richtigen Zellen sind zwei Domänen von ASSET: eine Lipoprotein-Domäne, die aus einer N-terminalen Signalsequenz und einer kurzen Peptidsequenz des Lipoproteins NlpA besteht; sowie eine Antikörper-Domäne, die das scFv-Fragment eines monoklonalen Antikörpers trägt. Die Funktionsweise von ASSET ist so einfach wie genial. Die Lipiddomäne geht in der Membran ­lipid-basierter Nanopartikel vor Anker, in denen siRNAs eingeschlossen sind und auf die Übergabe an die Zielzellen warten. Die scFV-Domäne dockt anschließend an die konstante Fc-Region eines Ratten-IgG2a-Antikörpers (RIg) an. Der RIg-Antikörper erkennt schließlich einen Rezeptor auf der Oberfläche der anvisierten Zelle und liefert die siRNA-beladenen LNPs an diese aus.

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Peers Mannschaft testete das ASSET-siRNA­-Zustellsystem zunächst in einer Makro­phagen-Zelllinie der Maus (CD44+CD34- RAW264.7). Diese Zellen tragen auf ihrer Oberfläche den Adhäsions-Rezeptor CD44. Sie sind jedoch negativ für das Oberflächenprotein CD34. Um die erfolgte Zustellung beobachten zu können, verwendeten die Forscher fluoreszenzmarkierte Cy5-siRNAs. Zunächst versetzten sie die mit Cy5-siRNAs beladenen ­LNPs nacheinander und in äquimolaren Mengen mit dem ASSET-Protein sowie einem gegen CD44 gerichteten RIg-Antikörper (CD44-RIg). Die so auf ihre Zielzellen (Target, T) eingestellten ­siRNA-LNPs ­(alpha CD44 TsiLNPs), verwendeten sie schließlich für Aufnahme-Experimente mit den Makrophagen. Tatsächlich belegen Fluoreszenzmikroskopie-Bilder, dass die Zellen Cy5-siRNAs importierten. Adressierten die Forscher die TsiLNPs jedoch mit einem CD34-RIg an den nicht vorhandenen Oberflächenmarker CD34, so war in den Makrophagen kein Fluoreszenzsignal zu erkennen.

Nachdem die Sache in vitro funktionierte, machte sich die Gruppe daran, Gene mit den TsiLNPs in vivo auszuschalten. Dazu injizierten die Forscher Mäusen anti-CD4-­TsiLNPs­ und untersuchten zunächst, ob die siRNAs in CD4-positiven Lymphozyten auftauchten. Nachdem sich dies bestätigt hatte, setzten die Israelis CD45-siRNAs in den TsiLNPs ein und analysierten anschließend die CD45-Expression in den Lymphozyten. Tatsächlich sank die CD45-Expression um etwa 60 Prozent.

Zielausrichtung mit Antikörper

Der Clou der Technik ist der einfache und schnelle Umstieg auf eine andere Zielzelle durch einen simplen Wechsel des Antikörpers. Die Gruppe bestückte die TsiLNPs mit Antikörpern gegen verschiedene Oberflächenmarker von T- und B-Lymphozythen – und immer landeten die TsiLNPs mit ihrer siRNA-Fracht exakt an der richtigen Adresse.

Natürlich sind auch mit der ASSET-Technik nicht alle Probleme Lipid-basierter Nanopartikel ausgeräumt – toxische oder andere negative Effekte der LNPs auf die Zellen hat die Gruppe nicht untersucht. Das präzise und einfach durchzuführende Ausrichten auf neue Zielzellen sollte sie aber für Grundlagenforscher genauso interessant machen, wie auch für Mediziner, die an RNAi-basierten ­Therapien arbeiten.

Harald Zähringer



Letzte Änderungen: 04.04.2018


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