Wenn Maispflanzen so aussehen, ist meist der Pilz Colletotrichum graminicola Schuld. Ohne SDS im Extraktionspuffer lässt sich die Pilz-DNA einfacher isolieren.
Manchmal reichen Kleinigkeiten, um ein etabliertes Protokoll zu beschleunigen.
Die Genotypisierung von Transformanden ist ein zeitaufwendiger aber nötiger Schritt, um anschließend die eigentlichen Experimente durchführen zu können. Die DNA von Dutzenden oder gar Hunderten Klonen zu extrahieren kann aber dauern.
Natürlich gibt es Polymerasen für die Direkt-PCR, nur kosten die meist derart viel, dass für die spannenden Experimente kein Geld mehr da ist. Daher haben wir ein einfaches und robustes DNA-Extraktionsprotokoll, das ursprünglich von Detlef Weigel und Jane Glazebrook für Arabidopsis entwickelt wurde, modifiziert (Arabidopsis: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA, 2002). Herausgekommen ist ein optimiertes Protokoll ohne überflüssige und zeitraubende Schritte.
Die Probe wird im Eppendorfgefäß mit 400 µl Extraktionspuffer (200 mM Tris-HCl (pH 7,5), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA) mit einer Kugelmühle zerkleinert (alternativ von Hand mit Eppi-Pistill). Für die Mühle gehen übrigens auch billige Kugellager-Kugeln, die man nach dem Gebrauch wegschmeißt.
Danach wird je nach Grad der Zerkleinerung für fünf bis zehn Minuten bei voller Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. In dieser Zeit wird die zweieinhalbfache Menge (zum Beispiel 715 µl) Ethanol in neue Eppis vorgelegt (mit Methyl-Ethyl-Keton vergällter Ethanol ist hier ausreichend). Noch schnell ein Volumen (zum Beispiel 285 µl) DNA Rohextrakt in jedes Eppi, vortexen und für fünf bis zehn Minuten zentrifugieren. Danach den Überstand abnehmen oder abgießen (eventuell kurz anzentrifugieren und das restliche Ethanol abpipettieren).
Je nach Menge können die Proben entweder an der Raumluft, für zwei Minuten im Vakuum oder im 37 °C Inkubator trocknen. Die so gewonnene DNA wird in 50 µl 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) aufgenommen. Für einen 12,5 µl PCR-Ansatz verwendet man je 1 µl.
Im Gegensatz zum Originalprotokoll lassen wir im Extraktionspuffer 0.5 % SDS, weg, weil dieses sehr stark schäumt. Zudem verzichten wir bei der DNA-Fällung auf Isopropanol und einen zusätzlichen Waschschritt mit Ethanol. Für Standard PCRs ist dieser unnötig und kostet nur wertvolle Zeit.
Das gekürzte Protokoll verwenden wir seit über einem Jahr, um DNA aus Arabidopsis thaliana und dem Pilz Colletotrichum graminicola zu extrahieren. Für Arabidopsis nehmen wir ein kleines Blättchen (10 bis 30 mg). Colletotrichum inkubieren wir in 1 ml Komplettmedium im Eppi für etwa eine Woche, dann wird fünf Minuten zentrifugiert und das Medium abgenommen.
Mit dem optimierten Protokoll spart man nicht nur Zeit, sondern auch Geld, weil weniger Pipettenspitzen benötigt werden und vergällter Ethanol billiger ist als Isopropanol bei der klassischen zweistufigen Fällung. Ganz Mutige lassen sogar die Zentrifugation des Rohextraktes weg und präzipitieren die DNA direkt mit dem Zelldebris. Das funktioniert zwar meist auch – aber nicht immer so reibungslos wie mit dem ungekürzten optimierten Protokoll.
Julia Frank und Mario Lange
(Institut für Agrar- und Ernährungswissenschaften, Universität Halle-Wittenberg)