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Tipp 19:
Nachweisgrenzen von Western-Blots

Andree Blaukat, Pharmakologisches Institut der Uni Heidelberg


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Ich habe seit meiner Doktorarbeit recht viel mit Antikörpern gegen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren zu tun. Aufgrund ihres hydrophoben Charakters, sind proteinchemische Arbeiten mit dieser Klasse von Proteinen ein recht unbequemes Thema. So hat es mich als jungen Doktoranden immer wieder verwundert, mit welcher Leichtigkeit einige Autoren die schönsten Banden aus geringsten Mengen an Zellmaterial mit endogenen Rezeptoren in Western Blots produzieren, wogegen in unserem Labor selbst die Detektion in überexprimierenden Zellsystemen selten gelang. Seitdem ich allerdings einmal überschlagen habe, wie viel Protein man wohl benötigt, um einen schönen Western Blot hinzuzaubern, ist mein Vertrauen in viele der publizierten Rezeptorbanden geschwunden.

Unter idealen Bedingungen kann man bestenfalls 2-10 fmol Protein im Western Blot nachweisen – realistisch sind aber wohl eher 10-100 fmol (Harlow and Lane, in Antibodies: A Laboratory Manual). Belädt man sein SDS-Minigel mit 20 µg Gesamtprotein – viel mehr geht nicht, wenn man eine akzeptable Trennung erreichen möchte –, so müsste das Ausgangsmaterial mindestens 100-500 fmol, realistisch wiederum eher 500-2500 fmol Rezeptor pro Milligram Gesamtprotein enthalten, um das Zielprotein detektieren zu können.

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Nur theoretische Chance

Leider sind aber in natürlichen Ge weben und kultivierten Zellen üblicherweise nur 10-200 fmol Rezeptor pro Milligram oder oft noch weniger zugegen. Dies kann man in Bindungs-Assays mit radioaktiv markierten Liganden recht exakt messen. Es müssen also schon viele glückliche Umstände zusammentreffen, um wenigstens auch nur theoretisch eine Chance zu haben, G Protein-gekoppelte Rezeptoren in Lysaten aus natürlichen Quellen“, will heißen aus nicht-überexprimierenden Zellen, im Western Blot zu sehen.

Berücksichtigt man dann noch, dass Transfer- und Solubilisierungsausbeuten von hydrophoben Transmembranproteinen, wie G Protein-gekoppelten Rezeptoren, selten bei 100%, sondern eher in der Größenordnung von 40 - 80% anzusiedeln sind, verschlechtern sich die Aussichten auf einen schönen Western Blot noch mehr. Zusätzliche Bauchschmerzen verursachen derart produzierte und publizierte Rezeptor Western Blots, wenn miserable kommerziell erhältliche Antikörper ohne adäquate Kontrollen verwendet werden, die im eigenen Labor noch nicht einmal zur Detektion von Unmengen bakterieller Fusionsproteinkonstrukte taugen.
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Letzte Änderungen: 08.09.2004


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