Salzsäure und Coomassie Brilliant Blau − fertig ist das sensitive Bradford-Reagenz.
Seit beinahe 40 Jahren verwenden Biowissenschaftler den Bradford-Assay, um die Konzentration von Proteinen zu bestimmen. Der Assay, der auf der Bindung des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blau G-250 (CBB) an Proteine und der anschließenden Absorptionsmessung des gebildeten Protein-CBB-Komplexes beruht, ist einfach durchzuführen und auch als Kit erhältlich.
CBB liegt je nach pH-Wert als kationisches, neutrales oder anionisches Molekül vor. Welche dieser Molekülspezies während des Bradford-Assays an die Proteine bindet war aber lange Zeit nicht klar. Erst 2008 ging Christos Georgious Gruppe von der Universität Patras der Sache auf den Grund. Sie fand heraus, dass offensichtlich die neutrale CBB-Form, die bei pH-Werten von 0,39 bis 1,3 dominiert, einen Komplex mit Proteinen eingeht. Die griechische Gruppe nutzte diese Erkenntnis auch sogleich für einen modifizierten Bradford-Assay, der wesentlich empfindlicher ist als der ursprüngliche Assay und dessen kommerzielle Varianten (C.D. Georgiou et al., Anal. Bioanal. Chem. 391, 391-403; siehe auch Lab Times 3/2009, Seite 56).
Der klassische Bradford-Assay ist einfach und schnell aber nicht besonders empfindlich. Weitaus sensitiver ist die in Mikroplatten durchgeführte griechische Variante. Foto: EIROforum
Die Einstellung des hierfür nötigen pH-Werts von 0,4 ist jedoch etwas umständlich und erfordert je nach Assay-Typ (Standard-, Mikroplatten- oder Mikro-Assay) eine Kombination aus Trichloressigsäure sowie Ammoniumsulfat oder Natriumphosphat. Konstantinos Grintzalis, einer der Mitautoren des 2008er Papers, der seine Arbeit in der Gruppe von Yves-Jacques Schneider an der Katholischen Universität Löwen in Belgien fortsetzte (und inzwischen an der Universität Birmingham gelandet ist), nahm sich die griechische Version des Bradford-Assays deshalb noch einmal vor und hat sie weiter vereinfacht (Grintzalis et al., Anal. Biochem. 480, 28-30).
Statt mit Trichloressigsäure, Ammoniumsulfat und Natriumphosphat stellt Grintzalis den pH-Wert des CBB-Reagenzes einfach mit 2N HCL her. Für eine 2-fach konzentrierte CBB-Lösung benötigt man 60 mg CBB, die man in 100 ml 2N HCL löst und 40 Minuten rührt (nicht gelöste Farbpigmente entfernt man anschließend durch Zentrifugieren für 10 Minuten bei 15.000 g und Raumtemperatur oder filtrieren). Diese Stammösung ist bei Raumtemperatur mehrere Monate stabil und wird vor Gebrauch 2-fach mit 2N HCl verdünnt.
Das hieraus resultierende CBB-Reagenz setzt man schließlich für den in Mikroplatten ausgeführten Bradford-Assay ein, bei dem man zunächst eine Standardkurve mit Rinderalbumin (BSA) oder einem anderen Referenz-Protein erstellt. Hierzu gibt man jeweils 50 μl der CBB-Lösung zu 200 μl einer Lösung, die 1 bis 40 μg/ml BSA enthält. Nach zehnminütiger Inkubation bei Raumtemperatur misst man die Absorption bei 610 und 470 Nanometer.
Verwendet man die Absorptionsmessung bei 610 Nanometer für die Konstruktion der Standardkurve, so verläuft diese bis etwa 20 μg BSA per ml linear und flacht dann ab. Bildet man dagegen den Quotienten aus den Absorptionsmessungen bei 610 und 470 Nanometern und erstellt die Standardkurve mit diesen Werten, so folgt sie auch bei Konzentrationen bis 40 μg BSA per ml einer Geraden.
Die Absorption der Proteinprobe misst man auf die gleiche Weise und bestimmt anschließend an Hand der Standardkurve deren Konzentration. Nach den Angaben von Grintzalis et al. liegt die untere Grenze für die Proteinquantifikation bei 0,2 μg. Der griechisch-belgische Bradford-Assay ist damit deutlich empfindlicher als kommerzielle Bradford-Kits und schlägt sich auch im Vergleich mit kommerziellen fluorometrischen Assays mit Nachweisgrenzen zwischen 10 ng/ml und 50 ng/ml nicht schlecht - und billiger als diese ist er allemal.
Harald Zähringer