Was kommt heraus, wenn man digitale PCR und hochauflösende Schmelzkurvenanalyse verbindet? Eine neue Methode für die Identifikation von DNA-Sequenzen.
Mit der hochauflösenden Schmelzkurvenanalyse (HRM) kann man DNA-Sequenzvarianten, zum Beispiel Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), einfach und schnell analysieren. Sie folgt in der Regel auf eine qPCR und wird wie diese in einem qPCR-Thermocycler durchgeführt. Dabei amplifiziert man die Ziel-DNA in Gegenwart eines interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffs, etwa EvaGreen, der bis zur vollständigen Sättigung an die DNA bindet. Erhöht man schrittweise die Temperatur, so lösen sich die beiden Einzelstränge langsam voneinander und setzen die Farbstoffmoleküle wieder frei. Aus einer Schmelzkurve, bei der die gemessene Fluoreszenz gegen die Temperatur aufgetragen wird, lässt sich das Schmelzverhalten der amplifizierten Sequenzprobe bestimmen. Da jede Schmelzkurve sequenzspezifisch ist und schon der Austausch einer einzigen Base ihre Charakteristik verändert, kann man mit der HRM-Analyse einzelne Sequenzvarianten sehr exakt unterscheiden.
Bei homogenen Proben funktioniert dies problemlos. Hat man es aber mit heterogenen Proben zu tun, die auch unbekannte Zielsequenzen enthalten, kommt die traditionelle HRM-Analyse ins Schleudern. Die Schmelzkurve spiegelt dann nicht mehr das Schmelzverhalten einer einzelnen Sequenz wider, sondern das einer Mischung verschiedener Sequenzen, die nicht unterschieden werden können. Zwar kann man mit Varianten der HRM-Analyse, etwa mit der Multiplex qPCR, bei der man die Ziel-DNA mit mehreren spezifischen Primer-Sets amplifiziert, auch einzelne Sequenzen auseinanderhalten. Deren Anzahl ist aber sehr eingeschränkt, und unbekannte Sequenzen erkennen die Primer auch in diesem Fall nicht.
Eine clevere Kombination aus digitalerPCR (dPCR) und HRM-Analyse, die eine Gruppe von der Johns Hopkins Universität in Baltimore vorstellte, löst diese Probleme (Fraley et al., Nucleic Acids Research, 41, e175). Mit der Technik, die die Gruppe Universal digital High-Resolution Melt, kurz U-dHRM, nennt, kann man sehr viele unbekannte Zielsequenzen parallel detektieren und voneinander unterscheiden. Da die U-dHRM-Analyse einfach durchzuführen ist und die Ergebnisse innerhalb weniger Stunden vorliegen, ist sie insbesondere für die Bestimmung pathogener Keime in klinischen Proben interessant.
Im Grunde ist die U-dHRM nichts anderes als eine in einer 96-Well Mikrotiterplatte durchgeführte digitale PCR mit anschließender HRM-Analyse der PCR-Produkte. Bei der dPCR verdünnt man die DNA-Probe zunächst solange, bis nur noch eine oder null Kopien in den einzelnen Wells der Mikroplatte vorhanden sind. Führt man mit diesen eine PCR mit universellen Primern durch, so resultieren aus den Einzel-Kopien homogene Amplikons, die man direkt für die HRM-Analyse einsetzt. Als Resultat erhält man viele verschiedene Schmelzkurven. Vergleicht man diese mit Standardkurven aus einer Datenbank, kann man die zugrundeliegenden DNA-Sequenzen identifizieren.
Die amerikanische Gruppe testete die Spezifität des U-dHRM-Verfahrens mit einer Mischung aus miRNAs der Let-7-Famillie, die sich nur in ein bis vier Nukleotiden unterscheiden, sowie miR-98 und miR-29 miRNAs. Hierzu versahen sie die miRNAs zunächst mit einer Tag-Sequenz, um die dPCR mit einem universellen Primer-Paar durchführen zu können. Die nach dPCR und HMR erhaltenen Schmelzkurven verglichen die Forscher schließlich mit Standard-Schmelzkurven, die sie im Vorfeld erzeugt und in einer Datenbank gespeichert hatten. Nach Angaben der Autoren erhielten sie nach der Optimierung der Reaktionsbedingungen reproduzierbare Schmelzkurven, mit denen sich die miRNAs in der Mischung eindeutig bestimmen ließen.
Ähnlich überzeugend verlief der Testlauf der U-dHMR mit einer Mischung aus 12 klinisch relevanten Bakterien, die bei der Sepsis eine Rolle spielen. Nach der Amplifikation der genomischen Bakterien-DNA mit Hilfe von universellen 16s rDNA-Primern und anschließender HRM-Analyse ließen sich auch in diesem Fall die erhaltenen Schmelzkurven eindeutig vorher erzeugten Standardkurven zuordnen.
So vielversprechend die Methode ist, hat sie doch noch einige Kinderkrankheiten. Es ist zum Beispiel nicht ausgeschlossen, dass zwei Amplikons mit unterschiedlichen Sequenzen durch puren Zufall identische Schmelzkurven erzeugen. Auch lässt sich die amplifizierte Sequenz mit dem derzeitigen Protokoll nicht quantifizieren. Hierzu müsste die Zahl der Reaktionen erheblich größer sein. Lösungen für diese kleinen Mängel dürften aber nicht lange auf sich warten lassen.
Harald Zähringer