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Tipp 173: Aktivitätstest: Succinat-Dehydrogenase

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Trick 173

Klärte den Zitratzyklus auf und erhielt dafür 1953 den Nobelpreis: Hans Krebs

Die Succinat-Dehydrogenase kennen Lebenswissenschaftler seit 80 Jahren als eines der Enzyme des Zitratzyklus. Genauso lange warten sie auf einen einfachen Aktivitätstest.

Viele Lebenswissenschaftler meinen, sie könnten keinen Blumentopf gewinnen, wenn in ihren Publikationen Schlagworte fehlen wie Next Generation Sequencing, RNAi, qPCR oder Nanoscopy. Das Gegenteil beweist ein aktuelles Paper von Andrew Jones und Judy Hirst vom Medical Research Council in Cambridge, in dem von so „altmodischen“ Dingen wie Zitratzyklus, Atmungskette, apparenten KMs und gekoppelten Enzymassays die Rede ist (Analytical Biochemistry, 442, 19-23).

Die beiden beschreiben in ihrer Arbeit einen einfachen, geldbeutelschonenden Enzymassay mit dem man die Aktivität der Succinat-Dehydrogenase in Enzymisolaten, Membranpreparationen oder Gewebehomogenaten messen kann. Die Succinat-Dehydrogenase alias ­Succinat:Ubiquinon Oxidoreduktase (Succinat-Q-Reduktase) oder Komplex II ist das einzige membranständige Enzym des Zitratzyklus. Der in die Matrix des Mitochondriums hineinragende Teil katalysiert die Oxidation von Succinat zu Fumarat. Gleichzeitig überträgt das Enzym in der inneren Mitochondrienmembran als Teil der Atmungskette Elektronen von FADH2 (das im Zitratzyklus entsteht) auf Ubiquinon und reduziert dieses zu Ubiquinol. Die Succinat Dehydrogenase ist somit ein wichtiges Bindeglied zwischen Zitratzyklus und Atmungskette.

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Alles nichts neues werden Sie sagen. Schließlich klärte Hans Krebs – den die Nazis 1933 aus seinem Labor an der Universität Freiburg vertrieben und der daraufhin in Cambridge und später in Oxford weiterforschte – den Zitratzyklus schon in den dreißiger Jahren auf. Seither wird der auch Krebs-Zyklus genannte Kreislauf jedem Biochemie- oder Biologie-Studenten solange in allen Details eingetrichtert bis er ihn im Schlaf an die Tafel malen kann.

Umso erstaunlicher ist aber, dass es nach Aussagen von Jones, und der Expertin für den Elektronentransport in der Atmungskette, Hirst, bis heute keinen einfachen und zuverlässigen Succinat-Dehydrogenase Assay gibt. Bei jedem der bestehenden Tests findet sich ein Haar in der Suppe.

Die übliche Messung mit einer Sauerstoff-Elektrode ist teuer und bestimmt im Grunde nicht die Aktivität der Succinat-Dehydrogenase, sondern die kombinierte Aktivität der ­Atmungskettenenzyme Komplex II, III und IV. Auch Succinat-Dehydrogenase-Assays, die mit künstlichen Elektronenakzeptoren arbeiten, deren Reduktion spektrometrisch verfolgt werden kann, sind, so Jones und Hirst, nicht spezifisch genug. Die Zwei machten deshalb aus der Not eine Tugend und entwickelten einen klassischen gekoppelten Assay mit dem sich die Succinat-Dehydrogenase-Aktivität direkt messen lässt.

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Der Assay verbindet die Aktivitäten der Enzyme Fumarat Hydratase (FumC) und Malat Dehydrogenase (Oxalacetat-decarboxylierend/NADP+) (MaeB) und verknüpft letztlich die Oxidation von Succinat stöchiometrisch mit der Reduktion von NADP+. Das heißt konkret: Succinat wird durch die Succinat Dehydrogenase zu Fumarat oxidiert, FumC lagert an Fumarat Wasser an, wodurch Malat entsteht, das von MaeB zu Pyruvat und CO2 umgesetzt wird. Das hierzu nötige NADP+ wird zu NADPH reduziert, das bei einer Wellenlänge von 340 bis 380 nm spektrometrisch gemessen wird.

Jones und Hirst exprimierten und reinigten FumC und MaeB selbst und verwendeten die Enzympreparationen für einige Testläufe mit dem gekoppelten Assay. In diesen verglichen sie den Assay zum Beispiel mit der Sauerstoff-Elektroden-Methode und einem Elektronenakzeptor-Assay (DCPIP-Assay). Setzten sie hierzu submitochondriale Partikel ein, fanden sie Succinat-Oxidationsraten, die mit aus Sauerstoff-Elektroden-Messungen erzielten Werten vergleichbar waren. Etwas differenzierter sah das Bild aus, wenn sie Komplex II-Isolate verwendeten und die Ergebnisse aus dem gekoppelten Assay und dem DCPIP-Assay gegenüberstellten. Hier resultierten aus dem gekoppelten Assay konstant höhere Succinat-Oxidationsraten als mit dem DCIP-Assay. Dies war auch der Fall, wenn die Beiden Gewebeproben statt Komplex II-Isolate einsetzten.

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Der gekoppelte Assay scheint also eine echte Alternative für alle zu sein, die die Aktivität der Succinat-Dehydrogenase oder der Elektronentransportkette als Ganzes messen müssen. Und er zeigt einmal mehr, dass einfache, altbewährte Standardverfahren der Biochemie noch längst nicht ausgedient haben.

Harald Zähringer

 

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Letzte Änderungen: 01.10.2013


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