Wenn Sven Löbrich nicht gerade mit dem Klonieren in Elly Nedivis Labor am Picower Institut in Boston beschäftigt ist, genießt er das Strandleben am nahen Atlantik.
Gerademal fünf Zutaten benötigt man für einen selbsthergestellten Ligation-Puffer.
Falls Sie viel klonieren, haben Sie sich vielleicht schon einmal gefragt, wie Sie Ihre Ligationen schneller, verlässlicher und günstiger durchführen können. Nein? Lesen Sie trotzdem weiter – es schadet nie, im Labor Zeit und Geld zu sparen. Ich jedenfalls kann mir tausend Dinge vorstellen, die ich machen würde, wenn ich beides übrig hätte (was leider selten der Fall ist). Ganz oben auf der Liste rangiert an den von unserem Labor am Picower Institute in Boston nicht weit entfernten Strand zu gehen und Margaritas zu trinken.
Teure, kommerzielle Ligation-Kits gibt es wie Sand am Meer. Besonders beliebt sind die sogenannten “Rapid Ligation Kits”, die weder eine Kühlung noch eine lange Inkubationszeit verlangen. Herkömmliche Ligationen laufen über Nacht bei 16 °C – mit einem Rapid Ligation Kit schaffen Sie es in zehn Minuten bei Raumtemperatur.
Diese Kits verschaffen Ihnen also jede Menge Zeit. Aber eins steht fest: Geld sparen Sie mit ihnen nicht. Sie können an den Strand fahren und sich einen schönen Tag machen, für die dazu gehörenden Margaritas reicht es aber nicht mehr. Da können Sie auch gleich im Labor bleiben und weiterarbeiten.
Rapid Ligation Kits enthalten keine ominöse „Speedy-Gonzales“-Ligase, sondern wie bei Standard-Ligation-Kits die gute alte T4 DNA Ligase. Das Geheimnis liegt vielmehr im Puffer. Weil dieser sehr viskos ist, verlangsamt er die Diffusion der Reaktionspartner und hat damit den selben Effekt wie die reduzierte Temperatur bei einer normalen Ligationreaktion. Dadurch erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass sich lose DNA-Enden treffen, mithilfe überhängender Nukleotide aneinander binden und schliesslich ligiert werden. Da der Ansatz nicht gekühlt ist, läuft die enzymatische Reaktion ungebremst ab. Zehn Minuten reichen deshalb locker aus, um die Ligation zu bewerkstelligen.
Ich habe das hausgemachte LigationProtokoll bei hunderten Klonierungen benutzt und es funktioniert immer. Na prima, werden Sie sagen, dann brauchen wir ja jetzt nur noch die Zusammensetzung des Puffers! Die Hersteller werden sich eher den rechten Arm abschneiden als Ihnen auf die Nase zu binden, was in ihren Ligation-Puffern enthalten ist. Zum Glück ist mein Drang zur Selbstzerstörung noch nicht so weit fortgeschritten – eigentlich erstaunlich, wenn man bedenkt, dass ich seit fünfzehn Jahren in der Wissenschaft arbeite.
Die entscheidende Pufferkomponente, die den Ligation-Zauber möglich macht, ist Polyethylenglykol (PEG). PEG, das als trockenes Pulver verkauft wird, ist billig und mit durchschnittlichen Molekulargewichten von 3350 g/mol bis weit über 20.000 g/mol erhältlich. In dem Ligation-Puffer haben sich PEGs mit niederen Molekulargewichten bewährt. Das Rezept für die hauseigene Ligation sieht dann folgendermaßen aus (genauere Infos finden Sie auch unter www.benchfly.com/video/61/make-your-own-rapid-ligation-kit/):
Das ergibt einen 2-fach konzentrierten Puffer. Weil sowohl ATP als auch DTT darin enthalten sind, ist es keine schlechte Idee, Aliquots herzustellen, bei -20 °C einzufrieren und wiederholtes Auftauen zu vermeiden. Für eine durchschnittliche Ligationreaktion peile ich normalerweise 20 µl Endvolumen an und ligiere 100 ng aufgereinigtes Plasmid-Rückgrat mit der dreifachen molaren Menge an Insert. Ein typischer Ansatz enthält schließlich die nachfolgenden Zutaten:
Kurz vortexen und runterzentrifugieren, dann bei Raumtemperatur 10 Minuten stehenlassen – fertig! Jetzt können Sie den Ansatz auf Eis kühlen, Ihre kompetenten Zellen zugeben und mit der Transformation weitermachen. Anschließend können Sie die Badehose einpacken, an den Strand gehen – und Margaritas trinken.
Sven Löbrich