Ortsspezifische Mutagenese-Verfahren sollten das anvisierte Nukleotid der Zielsequenz möglichst präzise treffen.
Wer gezielt Mutationen in DNA-Sequenzen einführen will, kann aus etlichen Mutagenese-Methoden auswählen. Eine neue Variante macht sich die TA-Klonierung zunutze.
Die Ortsspezifische Mutagenese (Sitedirected Mutagenesis) gehört in Laboren, die Struktur-Funktions-Beziehungen von Proteinen untersuchen zum Alltagsgeschäft. Aber auch bei Genexpressionsstudien oder Modifikationen von Vektoren ist sie unentbehrlich. Zu den am häufigsten verwendeten Varianten zählen die Overlap Extension-Mutagenese, die Megaprimer-Mutagenese oder das äußerst populäre Quick Change-Protokoll.
Eine schnelle und einfache Alternative zu diesen teilweise umständlichen, wenig effizienten oder teuren Methoden stellen die zwei Japaner Yoshifumi Adachi und Chihiro Fukuhara in Analytical Biochemistry vor (2012, 431, 66-8). Ihre Mutagenese-Technik basiert auf der TA-Klonierung. Bei dieser kloniert man keine Technischen Assistenten, sondern fügt ein PCR-Produkt, an dessen 3‘-Enden ein Adenin überhängt (3‘-A), in einen linearisierten Vektor mit 3‘-T-Überhängen ein. Die 3‘-A-Überhänge erhält man durch eine PCR mit einer Taq-Polymerase, die keine 3‘-5‘-Exonuklease Aktivität besitzt und 3‘-A-Überhänge produziert.
Der Trick, mit dem die beiden Japaner TA-Klonierung und Ortspezifische Mutagenese verbinden, ist frappierend einfach. Auf einem Plasmid sucht man sich zwei links und rechts der zu mutierenden Base gelegene A/T Basenpaare aus, die als Startpunkte für die bei der PCR nötigen Primer dienen. Damit das PCR-Produkt beziehungsweise der linearisierte, nicht mutierte Vektor die 3‘-A-Überhänge an der richtigen Stelle trägt, ist die Startposition der Primer entscheidend. Das 5‘-Ende des reversen Primers muss direkt vor dem 5‘-Adenin der Zielsequenz liegen und das 5‘-Ende des Vorwärts-Primers muss direkt hinter dem 3‘-Thymin der Zielsequenz hybridisieren.
Das mag etwas kompliziert klingen, wird aber schnell klar, wenn man sich den Plasmid und die Primer aufzeichnet. Bei der anschließenden PCR entsteht ein linearisierter Vektor mit 3‘-A-Überhängen, dem die zu mutierende Base und die links und rechts davon gelegenen Nukleotide bis zu den A/T-Startpunkten fehlt. In diese Lücke ligiert man ein synthetisiertes Oligo, das die gewünschte Mutation trägt und mit 3‘-T-Überhängen versehen ist. Plasmide, bei denen das mutierte Oligo in der korrekten Richtung integriert ist (das ist zur Hälfte der Fall), fischt man schließlich mit einer PCR heraus.
Mit dieser Mutagenese-Methode kann man ohne viel Aufwand nicht nur einzelne Basen austauschen, sondern auch Deletionen, Insertionen und Konversionen in die Zielsequenz einführen. PCR-Experten zucken vermutlich zusammen, wenn sie lesen, dass ein ganzes Plasmid mit einer Taq-Polymerase amplifiziert wird, die wegen der fehlenden 3‘-5‘-Exonuklease-Aktivität keine Proofreading-Aktivität besitzt. Die Japaner weisen deshalb daraufhin, dass das Plasmid nicht zu lang sein sollte, um das Fehlerrisiko bei der PCR zu minimieren. Nach ihren Erfahrungen funktioniert die Methode bei Plasmiden mit Längen von 4.000 bis 7.300 Basen jedoch tadellos.
Harald Zähringer