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Tipp 155:
Das Universal Oligo - Gel Shift Assay

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Drei statt zwei Oligos für einen Gel Shift Assay einzusetzen, muss nicht zwangsweise teurer sein. Im Gegenteil.

Wenn Molekularbiologen wissen wollen, ob und wie ein Protein mit einem DNA-Fragment wechselwirkt, führen sie meist einen Elektrophoretischen Mobilitäts Shift Assay, (EMSA), im Laborjargon auch Gel Shift Assay, durch. Bei diesem mischt man einen kurzen, mit einem Label versehenen DNA-Doppelstrang (RNA oder Einzelstrang-DNA funktionieren auch), der ein Bindemotiv für ein bestimmtes Protein beherbergt, mit dem gereinigten Protein oder einem Zellextrakt, der dieses enthält.

Anschließend trägt man die Mischung auf ein Polyacrylamid-oder Agarose-Gel auf und führt eine Elektrophorese unter nichtdenaturierenden Bedingungen durch. Da die freie gelabelte DNA-Probe wesentlich schneller durch das Gel marschiert als die gebildeten Komplexe aus Protein und gelabelter DNA-Probe, erscheinen letztere als nach oben verschobene Banden auf dem Gel.


Als DNA-Proben verwendet man in der Regel kurze Oligo-Doppelstränge, die man entweder mit 32P radioaktiv markiert oder mit einem Digoxigenin (DIG) oder Biotin-Label versieht. Der Umgang mit 32P macht jedoch nicht besonders viel Spaß und DIG sowie Biotin-gelabelte Proben verlangen zusätzliche Arbeitsschritte nach der Elektrophorese. Als Alternative bieten sich Fluoreszenz-gelabelte Proben an, die jedoch den Geldbeutel ziemlich stark strapazieren, insbesondere wenn man viele verschiedene DNA-Proben markieren muss.

Nicolas Jullien und Jean-Paul Herman, von der Universität Marseille haben sich deshalb eine modifizierte Labeling-Technik ausgedacht, die einfacher und kostengünstiger ist, als die oben aufgeführten Methoden (Nicolas Jullien und Jean-Paul Herman, BioTechniques 2011, 51, 267-269).

ie üblich verwenden auch die beiden Franzosen zwei komplementäre Oligos, die das Proteinbinde-Motiv enthalten. Der Trick ist, dass eines der Oligos ein verlängertes 3’-Ende trägt, das eine für jede Probe gleiche, universelle Sequenz aufweist. Dieser überhängende DNA-Schwanz hybridisiert im nächsten Schritt mit einem dritten, Fluoreszenz- oder Biotin-gelabelten Oligo, das Jullien und Herman Universelles Elektrophoretisches Gel Shift Oligonukleotid, kurz LUEGO, nennen.

Für das EMSA-Experiment mischt man zunächst die drei Oligos und lässt sie hybridisieren. Anschließend führt man mit der hieraus resultierenden Probe wie gewohnt die Gel Shift Elektrophorese durch. Da schon winzige Konzentrationen des universellen LUEG-Oligos für die Herstellung der kompletten Probe ausreichen, ist diese Methode äußerst sparsam.

Statt immer wieder für teures Geld neue gelabelte Oligos zu kaufen, wie bei den üblichen Verfahren, bestellt man das LUEG-Oligo einmal und kann es dann über Jahre in der Gefriertruhe aufbewahren. So hat man es sofort griffbereit, wenn man es benötigt und kann ein kleines Aliquot entnehmen. Die zwei zusätzlichen ungelabelten Oligos mit dem Proteinbinde-Motiv verursachen nur minimale Kosten und werden zumeist innerhalb kürzester Zeit geliefert.

Harald Zähringer





Letzte Änderungen: 30.11.2011


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