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Tipp 143:
Klonieren ohne Grenzen

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Trick 143a

Stellt Fusionskonstrukte und Deletionsmutanten mit der Restriktionsfreien Klonierung her: Christian Hessinger

Christian Hessinger stieß beim Stöbern auf der Webseite des Laborjournals (www.laborjournal.de) auf den Tipp „Hausgemachte Mutagenese“ (Tipp 126). Dabei fiel ihm gleich eine Ergänzung zu der dort beschriebenen Methode ein.


Tipp: RF-Klonierung

Mutationen oder Fusionskonstrukte kann man auch sehr einfach durch Restriktionsfreies Klonieren (Restriction Free Cloning, RF-Cloning) herstellen. Diese Methode wurde bereits vor einigen Jahren entwickelt, in einem aktuellen Paper beschreiben Tamar Unger und seine Kollegen vom Weizmann Institut in Israel verschiedene neue Anwendungen (Unger et.al, J. Struct. Biol. Vol. 72, 1, 34-44).

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Für die Herstellung eines Fusionskonstruktes durch RF-Klonierung muss man sich zunächst in einer PCR-Reaktion einen Megaprimer herstellen, dessen Enden mit einem Abschnitt auf dem Vektor der Wahl hybridisieren. Man benötigt für jeden Megaprimer ein Primerpaar, wobei eine Hälfte der Primer (25 bp) mit dem Vektor bzw. dem Fusionsgen paart und die andere Hälfte mit dem Insert.

Im Falle eines Fusionskonstruktes kommt man so auf vier Primer mit ca. 50 bp Länge. Eine Hälfte der 25 bp Überhänge dient im ersten PCR-Schritt der Hybridisierung mit den Inserts, die andere im nächsten PCR-Schritt der Hybridisierung mit dem Vektor beziehungsweise den zu fusionierenden Genen. An deren 3‘-OH-Ende beginnt die Polymerase zu synthetisieren und amplifiziert so den Vektor mit den integrierten Megaprimern. Nach der Transformation werden die Einzelstrangbrüche in den Bakterienzellen repariert und man erhält einen vollständigen Vektor mit dem integrierten Konstrukt.

Das hört sich verwirrend an, wird aber deutlich, wenn man sich die unten stehende Abbildung mit dem Schema der RF-Klonierung anschaut.

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Ich habe mit dieser Methode einen Keimbahntransformationsvektor für Drosophila hergestellt, der ein 2,5 kb großes cDNA-Insert enthielt, an das ich per PCR ein GFP-Gen angehängt habe. Dieser Vektor war stolze 12 kb lang, aber mit Hilfe der Kappa-HiFi-Polymerase lief die PCR reibungslos. Mit einer Variante dieser Methode habe ich auch Deletionskonstrukte hergestellt.

Die RF-Klonierung ist schnell, einfach und erzeugt weniger Background als eine klassische Klonierung. Außerdem sind der Phantasie, was die Modifizierung der Sequenzen anbelangt, kaum Grenzen gesetzt.

Christian Hessinger
(Institut für Genetik, Universität Mainz)




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Letzte Änderungen: 20.10.2010


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