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Tipp 141:
„Ausgekochte“ Agarose-Gele

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Trick 141a

Spezialist für die Trennung kurzer DNA-Fragmente in Agarose-Gelen: Andreas Dirksen

Die Herstellung konzentrierter Agarose-Gele ist relativ heikel. Andreas Dirksen erklärt, worauf man dabei achten muss.


Tipp: Agarosegele

Während meiner Diplomarbeit am Institut für Molekulargenetik in Mainz suchte ich nach einem Rezept für die Herstellung eines konzentrierten Agarose-Gels, mit dem ich kurze DNA-Fragmente mit möglichst hohem Durchsatz sauber elektrophoretisch trennen und quantifizieren konnte. Dabei stieß ich zufällig auf ein Protokoll von Fermentas, das den entscheidenden Tipp enthielt. („Alkaline Agarose Gel Electrophoresis“; www.fermentas.com/en/support/Application-Protocols). Im Prinzip muss man bei der Herstellung des Agarose-Gels nur eine Kleinigkeit ändern: Man gibt dem abgewogenen aufzukochenden Agarose-Puffer-Gemisch zusätzliche 15 bis 20 Prozent Wasser zu und „kocht“ dieses wieder heraus (die meisten konzentrierten Agarose-Lösungen schäumen sehr stark, wenn man sie erhitzt, deshalb muss man beim Erhitzen in der Mikrowelle vorsichtig sein und ein großes Gefäß benutzen).

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Ich gieße mit dieser Methode standardmäßig Gele mit einer Konzentration von drei bis fünf Prozent und trenne mit diesen DNA-Fragmente, die eine Längendifferenz von weniger als fünf Basenpaare aufweisen. Wenn die aufgetrennten Fragmente direkt nebeneinander laufen, sind die unterschiedlichen Laufdistanzen der Banden deutlich zu erkennen. Das Limit liegt nach meiner Erfahrung bei einer Gelkonzentration von 6,5 Prozent, hängt jedoch von der Stärke der verwendeten Agarose ab. Zudem sollten Sie darauf achten, dass die Elektrophorese-Schlitten oder Kassetten hohe Temperaturen aushalten, weil man das Gel gießen muss, sobald sich die kochende Lösung beruhigt.

Auch das Geld für teure Agarosen (und Zusätze), die für die elektrophoretische Trennung kurzer DNA-Fragmente angeboten werden können Sie sich sparen. Ich erzielte mit den normalen LE-Agarosen (Low Electroendosmosis) bessere oder gleichwertige Ergebnisse. Dabei kann es durchaus sinnvoll sein, mit den Elektrophorese-Parametern zu experimentieren.

Neben horizontalen Elektrophorese-Apparaturen, die sich sehr gut für hochkonzentrierte Agarose-Gele eignen, benutze ich auch dünne, vertikale fünfprozentige Gele (GENterphorese-Apparatur). Hier empfiehlt es sich, eine fünf Milliliter-Pipette sowie Spitzen und anderes benötigtes Zubehör im Steril-Schrank bei 60 bis 80°C vorzuwärmen.

Trick 141b

Trennung kleiner DNA-Fragmente in konzentrierten Agarose-Gelen. Das linke Gelbild stammt von einem horizontalen Agarose-Gel, als Marker dienten Low-Range-Marker (Banden li. und re. außen). Auf der rechten Seite ist ein kleines vertikales Gel zu sehen in dem 5 bp-, 10 bp-, Ultra-Low-Range-Fast- und Low-Range-Fast-Leitern (von li.) aufgetrennt wurden.


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Diese Gele sind zwar schwieriger zu gießen, haben aber den Vorteil, dass (auch bei Verwendung einprozentiger Gele), der Puffer das Gel von beiden Seiten umspült und besser kühlt. Ich lasse meine Vertikal-Gele meist im Eiswasserbad laufen (bei 400 V und 500 mA) so dass die Elektrophorese, auch bei größeren Fragmenten, nur fünf bis zehn Minuten dauert. Zusätzlich sollte man auch den Puffer (TBE) bei ­-20­°C­ im Kühlschrank vorkühlen und einen „Fast Marker“ als Molekulargewichts-Marker benutzen. Bei einprozentigen Gelen ist es ratsam, die Gel-Kammer ab und an zu bewegen, damit sich der heiße Puffer am Gel verteilt und es nicht schmilzt. Weil die Gele von unten anfangen zu schmelzen, schalte ich die Elektrophorese-Apparatur dazu kurz aus und werfe einen Kontrollblick auf die untere Gelhälfte.

Andreas Dirksen
(Institut für Molekulargenetik,
Gentechnologische Sicherheitsforschung und Beratung,
Universität Mainz)



Letzte Änderungen: 10.08.2010


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