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Tipp 14:
Verkürzte E. coli-Transformation

Wolfgang Mages, Lehrstuhl für Genetik, Universität Regensburg

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Die Transformation von E. coli mit Plasmiden ist im molekularbiologischen Labor tägliche Routine. Fast alle gebräuchlichen Klonier- bzw. Expressionssysteme für E. coli basieren auf kleinen high copy-Plasmiden mit Antibiotika-Resistenzmarkern.

Nach der Einschleusung rekombinanter Plasmide in die E. coli-Zelle folgt normalerweise eine 45 bis 60 minütige Inkubation in Vollmedium bei 37°C, um den Resistenzmarker vor der Selektion zu exprimieren. Ohne diese phänotypische Expression werden potentielle Transformanten beim ersten Kontakt mit einem bakterioziden Antibiotikum abgetötet oder, bei bakteriostatischen Antibiotika, im Wachstum inhibiert. Auf der Platte erscheinen dann keine Kolonien.

Bei Routineklonierungen (sticky ends, blunt ends, PCR-Fragmente) mit Plasmiden, die auf Ampicillin-Resistenz basieren (z. B. pUC, Bluescript, pQE) können Sie auf die phänotypische Expression - in diesem Fall der ß-Lactamase - verzichten und den Ansatz stattdessen sofort nach dem Hitzeschritt plattieren. Dieses Vorgehen liefert bei uns routinemäßig vergleichbare Zahlen transformierter Kolonien wie mit phänotypischer Expression.

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Letzte Änderungen: 08.09.2004


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