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Tipp 139:
Geschüttelt, nicht geschwenkt

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Trick 139a

Resuspendieren und kräftig schütteln: Modifizierte Lipofektion von HEK-293 Zellen.

Schon kleine Änderungen an Protokollen können manchmal wahre Wunder wirken. Tobias Wimmer erklärt, wie sich die Effizienz bei der Lipofektion mit einem einfachen Trick verbessern lässt.


Tipp: Lipofektion

Die lipidvermittelte DNA-Transfektion von Säugerzellen mit kommerziellen Transfektionslösungen läuft meist nach folgendem Schema ab: Zunächst mischt man das Transfektionsreagenz mit der DNA und inkubiert die Lösung etwa eine halbe Stunde, damit sich DNA-Lipid-Komplexe ausbilden können. Letztere tropft man dann auf die Zellen, die am Boden der Kulturschale anhaften, und schwenkt die Schalen kurz vorsichtig hin und her. Zu guter Letzt inkubiert man die Zellen für ein bis zwei Tage im Brutschrank und hofft, dass möglichst viele DNA-Moleküle den Weg ins Innere der Zellen finden. Bei den HEK293-Zellen, mit denen wir in der Regel arbeiten, waren dies aber meist erschreckend wenige: nur etwa ein Prozent der Zellen nahm die DNA auf.

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Trick 139b


Einfacher Trick, große Wirkung: Die vielen transformierten, grünfluoreszierenden HEK-293 Zellen sprechen für sich.

Die Transfektionseffizienz lässt sich jedoch mit einem einfachen Trick erheblich steigern. Statt die DNA-Lipid-Komplexe auf die adhärent wachsenden Zellen zu geben, löst man die Zellen mit Trypsin/EDTA oder Accutase von den Schalen ab, resuspendiert sie in Kulturmedium, gibt die Lipid-DNA-Komplexe dazu und inkubiert den Ansatz für fünf bis zehn Minuten in einem 50-Milliliter-Falcon-Tube. Anschließend schüttelt man die Zellsuspension bei 50 bis 80 RPM und plattiert die Zellen wieder aus. Diese raue Behandlung überstehen nicht alle Zellen. Die toten Zellen lassen sich jedoch einfach beseitigen, indem man das Zellkulturmedium wechselt, sobald die noch lebenden Zellen wieder angewachsen sind. Bei etwas robusteren Epithelzellen, etwa Hela-Zellen, kann man die DNA-Lipid-Komplexe wie gewohnt direkt auf die Zellen tropfen und stellt die Platte dann für etwa fünf bis zehn Minuten auf den Schüttler.

Durch diesen modifizierten, intensiveren Schüttelschritt konnten wir die Effizienz der Lipofektion von etwa einem Prozent auf über 80 Prozent steigern.

TOBIAS WIMMER
(Labor für molekulare Ophthalmologie, -Augenklinik Gießen)

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Letzte Änderungen: 05.06.2010


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