Info

Tipp 138:
Mit FRET und FACS auf Partnersuche

ANZEIGE

Info

Der neue Pipettierroboter Liquid Handling Station flow schützt Ihre wertvollen Proben vor Partikeln und Mikroorganismen. mehr

Trick 138

Schauen entspannt der nächsten FRET-FACS-Analyse entgegen: Carina Banning und Michael Schindler.

Sowohl der Förster-Resonanz­energietransfer als auch die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung basieren auf der Anregung fluoreszenzmarkierter Proteine. Was liegt näher als die beiden zu kombinieren und für die Analyse von Protein-Interaktionen einzusetzen?


Tipp: FRET-FACS

Wenn Proteomiker herausfinden wollen, welche Proteine miteinander wechselwirken, verlassen sie sich meist auf die zwei Klassiker der Proteininteraktions-Analyse, die Ko-Immunopräzipitation (Pull-Down-Assays) und den Yeast-Two-Hybrid-Screen. Beide Methoden haben aber Schwächen. Eine sauber kontrollierte Ko-Immunopräzipitation durchzuführen ist alles andere als trivial, ganz zu schweigen davon, dass man bei der Lyse der Zellen eine ganze Menge „Interaktion“ zerstört. Was nach der Zell-Lyse übrig bleibt, ist eine Detergenzien-Brühe aus Zellmatsch, in der alles Mögliche aneinander hängt oder eben auch nicht. Yeast-Two-Hybrid-Screens, mit denen man native Proteinwechselwirkungen in lebenden Zellen untersucht, funktionieren nur in Hefen, und auch beim aufwändigeren Mammalian-Two-Hybrid Screen muss die Interaktion der Proteine im Zellkern stattfinden damit die Selektionsmarker exprimiert werden.

ANZEIGE

Info

Alle 11 Minuten verliebt sich eine Stammzelle in StemFit®... mehr


Eine Alternative zu Ko-Immunopräzipitation und Two-Hybrid-Screen hat kürzlich die Gruppe um Michael Schindler vom Heinrich-Pette-Institut für experimentelle Virologie und Immunologie in Hamburg vorgestellt (Banning et al., PLoS One. 5(2): p. e9344).

Die Gruppe kombiniert für die Proteininteraktions-Analyse die zwei Verfahren, Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) und Durchflusszytometrie (FACS).

Die FRET-Analyse benutzen Forscher schon seit geraumer Zeit, um Protein-Interaktionen in lebenden Säugerzellen in ihrem natürlichen Kompartiment zu studieren. Hierzu müssen die zu untersuchenden Proteine an ein Fluoreszenz-Molekül gekoppelt sein. Interagieren die beiden Proteine, wird Energie von einem angeregten Donor-Molekül (Fluoreszenz-Farbstoff CFP) auf ein Akzeptor-Molekül (Fluoreszenz-Farbstoff YFP) übertragen. Voraussetzung für den Energietransfer ist die direkte räumliche Nähe (weniger als zehn Nanometer) der verwendeten Fluorophore und die spektrale Überlagerung von Donor-Emission und Akzeptor-Anregung. Da die Größe von Proteinen meist auch im Zehn-Nanometer-Bereich liegt, kann man bei einem positiven FRET-Signal davon ausgehen, dass die zwei Proteine nicht zufällig so nah beisammen sind.

ANZEIGE

Info

Ab dem 11.5. zeigen 3.800 Aussteller aus aller Welt Innovationen für Chemie, Pharma- & Lebensmittelindustrie ... mehr


In der Theorie ist die Protein-Interaktionsanalyse mittels FRET einfach und einleuchtend, die experimentelle Umsetzung ist aber, wie so oft in den Biowissenschaften, voller Fallstricke. Das fängt damit an, dass man FRET-Experimente bisher mit dem Fluoreszenzmikroskop analysierte, statistische Aussagen daher nur bedingt möglich waren. Hinzu kommt, dass die schwachen FRET-Signale in der starken Hintergrundfluoreszenz fast untergehen. Will der Forscher korrekt arbeiten, muss er etliche Referenzbilder aufnehmen und deren Werte in eine komplexe Berechnung integrieren. Die dazu nötigen Software-Programme und Plug-Ins kosten zum einen Geld, zum anderen ist die Auswertung sehr zeitaufwändig.

Einfacher, schneller und transparenter lassen sich FRET-Signale mit Hilfe eines Durchflusszytometers messen. Mit der von uns entwickelten FRET-FACS-Methode können Biowissenschaftler FRET-Signale in intakten, lebenden Zellen schnell und reproduzierbar detektieren. Ausschlaggebend für die FRET-Analyse mittels Durchflusszytometer sind die richtige Gating-Strategie und die damit verbundenen Kontrollen (Details dazu finden Sie in der oben genannten Publikation). Die Protein-Interaktionen kann man im Anschluss an den FRET-FACS-Lauf anhand der Prozentzahlen FRET-positiver Zellen quantifizieren.

Die FRET-FACS-Methode ist für die Analyse verschiedenster Protein-Interaktionen geeignet. Wir haben mit ihr unter anderem virale Protein-Interaktionen in lebenden Zellen analysiert, Proteinbindedomänen charakterisiert sowie Multimerisierungen nachgewiesen. In Zukunft wollen wir die Methode einsetzen, um in Hochdurchsatz-Screens Inhibitoren für etablierte Interaktionen zu finden und unbekannte Protein-Interaktionen zu identifizieren.

C. Banning & M. Schindler

ANZEIGE

Info

Kapazität für 24 Gefäße und eine Geschwindigkeit von bis zu 21.330 × g mehr

ANZEIGE

Info

Whether you are considering using Droplet Digital PCR in the future, or already using it every day, this meeting is the perfect opportunity to ... mehr



Letzte Änderungen: 26.04.2010


Diese Website benutzt Cookies. Wenn SIe unsere Website benutzen, stimmen SIe damit unserer Nutzung von Cookies zu. Zur ausführlichen Datenschutzinformation