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Tipp 137:
Sepharose raus, Fractogel rein

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Wenn etablierte Methoden, wie die Tandem-Affinitätsreinigung von Proteinen fehlschlagen, schmeißen viele die Brocken hin. Bei manchen stachelt dies aber erst recht den Ehrgeiz an und sie tüfteln so lange bis die Sache funktioniert.


Tipp: TAP mit Fractogel

Die Tandem-Affinitätsreinigung, kurz TAP, ist in Laboren die Proteininteraktionen als Forschungsschwerpunkt angeben, eine ziemlich angesagte Methode. Das ist nicht weiter verwunderlich, mit der TAP lassen sich Proteinkomplexe sehr effektiv und in wenigen einfachen Schritten reinigen.

Wer eine TAP durchführen will, muss sich zunächst ein Fusionsprotein aus dem Zielprotein und einem angehängten TAP-Tag basteln. Letzterer besteht aus dem Calmodulin-Bindeprotein (CbP), einer Schnittstelle für die TEV-Protease und der Z-Domäne von Protein A. Das Fusionsprotein schüttelt man im ersten Schritt der TAP in einer kleinen Säule zusammen mit Proteinen aus einem Zellextrakt und Kügelchen aus Immunglobulin (IgG) dekorierter Sepharose. Protein A (am Ende des N- oder C-terminal angehefteten TAP-Tags), bindet mit hoher Affinität an IgG und verankert das Fusionsprotein an den IgG-Sepharose-Beads.

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Nach einem kurzen Waschschritt kappt die zugegebene TEV-Protease die Verbindung des Fusionsproteins mit IgG, worauf sich das Fusionsprotein äußerst sanft von der Säule eluieren lässt, ohne den Komplex aus Zielprotein und mit ihm wechselwirkenden Proteinen zu zerstören. Um möglichst alle Verunreinigungen los zu werden, wiederholt man das Ganze, dieses mal jedoch auf einer mit Calmodulin-Kügelchen gefüllten Säule. In diesem zweiten Schritt bindet CbP am Endes des TAP-Tags (Protein A wurde ja von der TEV-Protease abgeschnitten) an die Calmodulin-Beads. Bleibt im letzten Schritt nur noch die Säule zu spülen, um auch hartnäckige Verunreinigungen loszuwerden und das Fusionsprotein, einschließlich Interaktionspartner, anschließend mit EGTA von den Calmodulin-Beads zu lösen.

Theoretisch sollte die mit IgG-Sepharose durchgeführte TAP für beliebige Zielproteine funktionieren, tut sie aber nicht, wie Kenneth Sawin und Claudia Bicho von Hilary Snaiths Gruppe an der Universität Edinburgh kürzlich feststellten (Kenneth E. Sawin et. al., Anal. Biochem., 397, 241-243). Die drei wollten mit der TAP, Interaktionspartner des Zellpolaritäts-Regulators Tea1 aus der Hefe Schizosaccharomyces pombe isolieren, das Tea1-TAP Fusionsprotein mussten sie nach dem TEV-Protease-Schritt jedoch mit roher Gewalt, in Form chaotroper Substanzen, von den Sepharose Beads spülen.

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Sparsame Schotten

Das schottische Team ließ sich durch diesen Fehlschlag jedoch nicht beirren, und nahm ihn zum Anlass eine Alternative zur TAP mit Sepharose-IgG-Beads zu entwickeln. Dazu koppelten sie IgG zunächst an eine Matrix aus Dynabead-Kügelchen und setzten diese für die TAP-Reinigung von Tea1 ein. Tatsächlich funktionierte die TAP auch mit der Dynabead-IgG-Matrix perfekt, die teuren Dynabeads rissen den sparsamen Schotten aber zu große Löcher in das Laborbudget. Auf der Suche nach einem günstigeren synthetischen Säulenharz, stießen sie schließlich auf Fractogel EMD, an das sich IgG ebenfalls koppeln lässt (wie die Gruppe die Kopplung von IgG an das Fractogel-Harz im Detail bewerkstelligte, erklärt sie in den Supplementary Materials ihres Papers). Mit den Fractogel-Beads gelang Sawin et al. nicht nur die TAP-Reinigung von Tea1 reibungslos, auch viele weitere Fusionsproteine, die die Gruppe testete, ließen sich mit der Fractogel-IgG-TAP reinigen. Darüber hinaus eignet sie sich, so die schottische Gruppe in ihrem Paper, auch für die schnelle Einschritt-TAP (ohne den abschließenden Calmodulin-Reinigungsschritt) von Proteinkomplexen.

Harald Zähringer

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Letzte Änderungen: 26.04.2010


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