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Tipp 118:
Strippen im Labor - Stripping-Puffer für Western-Blots

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Zuverlässige -80°C in Gefrierschränken werden mittels luft- oder wassergekühlter Kompressoren erzeugt. mehr

Diana Neumann

Diana Neumann
(Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Universität Tübingen)

Strippen ist in vielen Arbeitsgruppen sehr beliebt. Ganz besonders dann, wenn in diesen Western Blots zum täglichen Geschäft gehören.

Stripping-Protokolle von Western Blot- Membranen – vor allem PVDF-Membranen – funktionieren meist nur unbefriedigend, wenn die Antikörper zu stark an die geblotteten Proteine gebunden haben. Als besonders hartnäckig stellten sich bei uns anti-beta-Aktin-Antikörper heraus, die sich mit unserem hausinternen Protokoll, das eine Behandlung mit 50 mM NaOH bei Raumtemperatur vorsah, nicht ablösen ("strippen") ließen. Wenn man dann zu allem Übel von den Protein-Proben nur kleine Mengen gereinigt hat, wird's brenzlig. Wir mussten uns deshalb nach einer alternativen Strip-Methode umschauen.

Die meisten Stripping-Protokolle denaturieren die gebundenen Antikörper entweder bei sauren/basischen pH-Werten, bei Einwirkung von Wärme oder Detergenzien. Wir haben einige der gängigen Protokolle getestet, die (scheinbar) meistgenutzten Stripping-Protokolle mit dem unangenehmen b-Mercaptoethanol (giftig) jedoch nicht weiter in Betracht gezogen. Statt dessen gingen wir auf die Suche nach alternativen Protokollen.
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Dabei fiel uns ein Protokoll in die Hände, bei dem man die Membran mit 100 mM Glycin (pH 2,9) für dreißig bis sechzig Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Klingt einfach – funktionierte aber nicht. Eine weitere Stripping-Lösung mit 200 mM Glycin, 0,1% SDS und 1% Tween (pH 2,2) sollte man gemäß Protokoll zwei Stunden bei 37 °C inkubieren. Auch dieses Protokoll lieferte keine überzeugenden Resultate – und war darüber hinaus auch noch zeitaufwändig.

Aus der Fülle verschiedener Protokolle haben wir schließlich unseren eigenen "Stripping-Cocktail" zusammengestellt, der auch tatsächlich funktioniert und sehr gute Ergebnisse liefert.

Hier unser Rezept für das Strippen von Western-Blot Membranen:

Man behandelt die Membran eine Stunde lang bei 55°C mit einer Lösung aus 100 mM NaOH, 2 % SDS und 0,5 % DTT. Am besten gibt man die PVDF-Membran (verhält sich chemisch neutral) in ein Bluecup-Röhrchen und strippt sie ganz bequem in einem Hybridisierungsofen.

Fazit: Unser Stripping-Puffer ist eine sinnvolle, zeitsparende und praktikable Alternative zu den bisherigen b-Mercaptoethanol-haltigen Stripping-Lösungen.

Diana Neumann
(Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Universität Tübingen)


Abb. 1

Um die Strip-Effizienz sicher zu stellen, wurde der Aktin-Blot (A) nach dem Strippen ohne Primär-Antikörper nur mit dem spezifischen Sekundär-Antikörper (B) inkubiert (Kontrolle). Blot C zeigt den gestrippten, erneut mit Primär- und Sekundär-Antikörper entwickelten Blot.
















Letzte Änderungen: 09.02.2008


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