Tipp 112:
Vakuumeluator für Midipräp-Säulen

Wenn Midipräp-Kits nicht funktionieren, wie sie sollen, bleiben zwei Möglichkeiten: In den Mülleimer schmeissen und den Lieferanten wechseln oder solange daran feilen, bis alles passt. Kostja Renko von der Berliner Charité entschied sich für letzteres.

Bis vor kurzem hatten wir in unserem Labor bei der Isolierung von Plasmid-DNA nur die Wahl zwischen Minipräps und Maxipräps. So richtig glücklich waren wir mit keiner der beiden Möglichkeiten. Minipräps liefern meist nicht genug Plasmid-DNA, um nach dem Kontroll-Verdau noch ein paar eukaryotische Zellen zu transfizieren. Bei Maxipräps ersäuft man dagegen in DNA. Nur um etwas auszuprobieren sind Maxipräps zu schade, weil der Preis pro Präparation recht hoch ist.

Der goldene Mittelweg heißt Midipräp! Uns wurde Promegas PureYield Plasmid Midiprep System empfohlen. Ein wichtiger Teil des PureYield Systems ist ein Vakuum-Tank mit dem putzigen Namen Vac-Man, den man an eine Vakuumpumpe anschliesst. Mit dem Vac-Man, den wir wegen seiner zylindrischen Form und den vielen Anschlüssen auf der Oberseite nur "Stachelschwein" nennen, können Sie 20 Präparationen gleichzeitig durchführen. Dazu steckt man die Reinigungssäulen auf einen der Anschlussstutzen des Vac-Mans, legt ein Vakuum an und "zieht" das Lysat damit durch die Säulenmembran. Die im Lysat enthaltene DNA bindet an die Membran und muss dann nur noch von der Säule eluiert werden. So weit die Theorie.

In der Praxis verlief die DNA-Präparation mit dem PurYield Kit entäuschend, weil die Elution der DNA nicht richtig funktionierte. Wie im Manual angegeben, pipettieten wir 600 µl Wasser auf die Membran und zentrifugierten die Säulen in unserer Kühlzentrifuge mit Festwinkelrotor. Nach der angegebenen Zentrifugationszeit fanden wir jedoch nur einen kleinen Bruchteil der aufgetragenen Flüssigkeit wieder. Ein Blick in die Anleitung schien das Rätsel zunächst zu lösen. Laut Promega muss man die Säulen in einer Zentrifuge mit einem Swingout-Rotor zentrifugieren. Obwohl Swing-Out Rotoren nicht gerade zur Standardausstattung eines Labors gehören, trieben wir in unserer Zellkulturabteilung eine entsprechende Zentrifuge auf. Aber auch mit dieser waren die "Wiederfindungsraten" schlecht (möglicherweise weil der benutzte Rotor nicht im 90°-Winkel ausschwang).

Da ich von dem "Stachelschwein" begeistert war, dachte ich mir, dass auch der Elutionsschritt mit Hilfe eines Vakuums funktionieren müsste und konstruierte den pTER-Eluator. Dieser holt das Eluat mittels Vakuum schnell und vor allem vollständig von der Säule. Und das auch noch mit wenig Aufwand.

Für den Bau des pTER-Eluator brauchen Sie folgende Teile und Werkzeuge:

• Eine gerade Kunststoff-Olive und einen Kunststoff-Tubus aus Polypropylen.
• Eine Dichtung aus Silikonkautschuk. (gibt es z.B.von der Firma Carl Roth als Ersatz-Montage-Set)
• Ein 50 ml Falcontube
• Eine (gebrauchte) Membransäule, die in das Falcontube passt
• Ein Taschenmesser

Den Bauplan für den pTER-Eluators und eine Skizze des Funktionsprinzips finden Sie HIER (Rot gestrichelte Linien markieren Schnittkanten). Eine Midipräp mit dem verbesserten PureYield System dauert bei uns etwa 45 Minuten, die Ausbeuten liegen zwischen 250 und 500 Mikrogramm. Fünf Midipräps sind in etwa so teuer wie ein Maxipräp. Gutes gelingen!

(Kostja Renko, Institut für Experimentelle Endokrinologie, Charité-Universitätsmedizin Berlin)


Letzte Änderungen: 09.02.2008