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Tipp 11:
Nimm drei (nicht zwei),oder: Three Way Ligations

Jürgen Stolz, Lehrstuhl Zellbiologie und Pflanzenphysiologie, Uni Regensburg

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Immer wieder verursachen Ligationen in eng benachbarten Restriktionsschnittstellen Probleme. Ligiert man den mit beiden Enzymen geschnittenen Vektor ohne Insert, dann findet man häufig eine hohe Anzahl an Kolonien. Diese rühren her von nur einfach verdauten Vektoren, die im Agarose-Gel nicht von der zweifach geschnittenen DNA getrennt werden können. Manchmal ist dieser Hintergrund so hoch, dass mit Insert-DNA keine höhere Anzahl an Kolonien beobachtet wird.

Diese ineffektive Situation können Sie umgehen: Wählen Sie eine dritte Schnittstelle C in der Vektorsequenz und schneiden Sie den Ausgangsvektor dann in zwei parallelen Reaktionen, mit A+C und B+C. Enzym C sollten Sie so wählen, dass die im AC- und BC-Verdau entstehenden Fragmente gut unterscheidbar sind. In der Folge werden die benötigten AC- und BC-Banden aus dem Gel isoliert. Weil sich die Größen dieser Fragmente von den nur einmal geschnittenen Vektoren unterscheiden, haben Sie eine gute Kontrolle über die Vollständigkeit des Verdaus und es besteht keine Gefahr, nur einmal geschnittene Vektoren zu isolieren. In die Ligation werden dann beide Vektorfragmente (AC und BC) und das mit AB geschnittene Insert eingesetzt. Kontroll-Ligationen ohne Insert ergeben nun keinen Hintergrund mehr, Ligationen mit Insert ergeben eine hohe Anzahl an Transformanden. Der höhere Aufwand bei der Gewinnung der Fragmente lohnt sich. Selbst PCR-Produkte mit terminalen und daher ineffektiv zu schneidenden Restriktionsstellen können Sie so problemlos ligieren.

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Letzte Änderungen: 08.09.2004


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