(06.09.2022) Der Lämmli-Puffer ist seit 52 Jahren Standard bei der SDS-PAGE. Konkurrenz macht ihm ein kanadischer Laufpuffer, der die Elektrophorese beschleunigt und kleine Proteine genauso gut trennt wie große.
SDS-PAGE-Protokolle sind wie Großmutters Backrezepte: Sie funktionieren seit Jahrzehnten und mit dem, was dabei herauskommt, ist man eigentlich ganz zufrieden. Eigentlich. Einen besseren Kuchen in kürzerer Zeit herzustellen, klingt dennoch verlockend. Das klassische Rezept ist dafür schon einmal eine gute Grundlage. Im Fall der SDS-PAGE stammt es von dem Schweizer Ulrich Lämmli, der es 1970 als Postdoc im Labor von Aaron Klug in Cambridge, UK, entwickelte, um Strukturproteine des Phagen T4 mit der SDS-PAGE zu analysieren (Nature 227: 680-5).
An den Eckpfeilern von Lämmlis Rezeptur hat sich seither nichts Wesentliches verändert: Das Sammelgel besteht aus vier- bis sechsprozentigem Polyacrylamid in Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 6,8; das Trenngel je nach Größe der zu trennenden Proteine aus zehn- bis zwanzigprozentigem Polyacrylamid in einem Tris-Puffer mit pH 8,8. Als Laufpuffer verwendete Lämmli eine wässrige Lösung mit 28 millimolarem Tris, 192 millimolarem Glycin sowie 0,1 Prozent SDS, den pH-Wert stellte er auf 8,3 ein.
Im Sammelgel liegt Glycin als Zwitterion vor, die meisten Proteine sowie das kleine Chlorid hingegen als Anion. Nach dem Einschalten des Elektrophorese-Geräts wandern die Chlorid-Anionen vorneweg in Richtung Anode, gefolgt von den auf das Gel aufgetragenen Proteinen. Die Glycin-Front bildet das Schlusslicht. Nach Erreichen des Trenngels bleiben die Chlorid-Anionen in der Pole-Position. Das kleine bei pH 8,8 als Anion vorliegende Glycin überholt hier jedoch die Proteine, die im Trenngel gemäß ihrer Größe separiert werden.
Bei Proteinen mit Molekulargewichten unter 15 Kilodalton ist die Auftrennung relativ dürftig, weil die Glycin-Anionen, anders als im Sammelgel, nicht mehr als patrouillierende Front hinter den Proteinen herlaufen. Die hieraus resultierenden verschwommenen Banden vermeidet Danuta Radziochs Team an der McGill University in Montreal, Kanada, mit einem modifizierten Laufpuffer (Anal. Biochem. 653: 114789). Die Gruppe vermutete, dass zusätzliche Anionen-Fronten im Laufpuffer die Proteine dazu bringen sollten, im Trenngel geordneter zu marschieren. Schon 2013 hatte sie für Western Blots ein Puffergemisch aus HEPES (pH 6,8 bis 8,2) und Tricin (pH 7,4 bis 8,8) entwickelt (Anal. Biochem. 441: 182-4). Bei der SDS-PAGE würde dieser Puffer die gesamte pH-Spanne von Sammel- und Trenngel abdecken, im Trenngel sollten mit ihm vier Fronten entstehen: Vorneweg die Chlorid-Ionen, gefolgt von Tricin sowie HEPES und am Ende die Proteine. Zudem würde ein vertikaler Protonengradient entstehen, der das Laufverhalten der Pufferionen entsprechend ihres pKa-Wertes diktiert.
Ein farbiges Sammelgel erleichtert bei der SDS-PAGE das Beladen der Probentaschen. Foto: Makoto Hagiwara
Um ihre Hypothese auf den Prüfstand zu stellen, trennten die Kanadier Proteinmarker in einer SDS-PAGE und verwendeten dazu Laufpuffer (0,1 Prozent SDS, pH 7,5 bis 8) mit verschiedenen Tris-Cl/Tricin/HEPES-Verhältnissen. Ihr optimierter „Fast Running Buffer“ enthält 100 mM Tris, 100 mM Tricin sowie 100 mM HEPES; er trennt Proteine mit Molekulargewichten von 15 bis 460 Kilodalton. Die Elektrophorese dauert nur 35 Minuten. Leider heizen sich insbesondere engmaschige Gele (PA 8 Prozent, 10 Prozent) dabei stärker auf als mit dem Lämmli-Puffer. Mit einer simplen Modifikation lässt sich dies jedoch vermeiden: Die Polyacrylamid-Gele stellt man dazu mit Tris-Acetat anstelle des üblichen Tris-Cl her. Auch das Western-Blotting dieser Gele funktioniert einwandfrei.
Ein weiteres in Analytical Biochemistry veröffentlichtes SDS-PAGE-Rezept soll das Beladen der Probentaschen erleichtern, die man in dem durchsichtigen Sammelgel meist kaum sehen kann. Um die Taschen besser zu erkennen, färbt Makoto Hagiwara von der University of Niigata Prefecture in Japan das Sammelgel mit einem Lebensmittelfarbstoff (Anal. Biochem. 652: 114751). Der Japaner verwendet hierzu gelbes Tartrazin, blaues Brilliantblau FCF oder orangefarbenes Neucoccin, das er in kleinen Mengen von 0,02 bis 0,035 Prozent in die Sammelgele mischt. Das Laufverhalten der Proteine wird durch die Farbstoffe nicht beeinflusst, auch die Proteinmarker bleiben erkennbar. Bei Western-Blotting und Ponceau-S-Färbung verhalten sich die gefärbten Gele wie ungefärbte.
Da die negativ geladenen Farbstoffe während der Elektrophorese mitwandern, erscheinen sie im Trenngel als Bande: Tartrazin und Neucoccin überholen die Bromphenolblau-Bande des Ladepuffers knapp, Brilliantblau FCF liegt mit ihr gleichauf. Mit Tartrazin oder Brilliantblau gefärbt ist das Sammelgel nach der Elektrophorese farblos, mit Neucoccin erscheint es blass-orange, was das Abschneiden vom Trenngel umso einfacher macht.
Andrea Pitzschke
